Диссертация (1144279), страница 10
Текст из файла (страница 10)
RITC-конъюгированный с BSA используют в качестве флуоресцентного агента по двум причинам. Первый заключается в том, что родаминявляется очень распространенным органическим красителем широко применяемый для флуоресцентной визуализации in vivo. В свою очередь, BSAшироко используется в качестве модели макромолекулы для экспериментов по капсулированию химических агентов. Кроме того, изоэлектрическаяточка BSA в водной среде находится в пределах рН = 4,7 [112], таким образом, при нейтральных значениях рН, BSA заряжается отрицательно и может быть послойно адсорбировано на поверхности покрытой положительнозаряженным полиэлектролитом.
Наночастицы магнетита были встроены воболочку, чтобы капсулы реагировали на дистанционного локального накопления магнитным полем. Показано, что наночастицы магнетита имеютярко выраженные магнитные свойства, стабильность, биосовместимость и,62следовательно, идеально подходят для биологических и медицинских применений [113]. Однако следует учитывать, что наночастицы магнетита гасятфлуоресценцию соседних флуорофоров [114].
Следовательно, слой магнитных наночастиц и слои с флуоресцентным RITC-BSA разделялись несколькими полиэлектролитными бислоями, чтобы избежать гашения. На рисунке3.3б представлены конфокальные изображения полученных микрокапсул.5 мкм3 мкмРисунок 3.4 — СЭМ изображения магнитных флуоресцентных микрокапсулФорма микрокапсул анализировалась с помощью СЭМ изображений(рисунок 3.4). SEM-изображения типичны для свернувшихся после сушкимикрокапсул. Можно заметить, что капсулы довольно однородны со средним диаметром 3 мкм.3.5 In vitro магнитный захват микрокапсулПервые эксперименты были посвящены исследованиям in vitro, чтобы подтвердить возможность визуализации микрокапсул в потоке цельнойкрови, а также проверить возможность их адресации при помощи внешнегомагнитного поля.Внутренняя областькапилляра250100Стенка150Стенка200МагнитМагнитная индукция, мТл6350000,4 0,8 1,2 1,6 2,0 2,4 2,8 3,2d, ммРисунок 3.5 — Распределение магнитного поля постоянного магнита впределах стелянного капилляра.
Каждая точка графика соответствуетсреднему значению по трём измерениям магнитного поля.На рисунке 3.6 представлены флуоресцентные изображения микрокапсул в стеклянном капилляре прямоугольного сечения до и послеактивации магнитного поля. Возбуждение флуоресценции производилосьпри помощи равномерного освещения капилляра лазером на длине волны532 нм. Белая стрелка обозначает направление кровотока.
Белые пятнаво всей области потока соответствуют свечению микрокапсул. Большоебелое пятно на капиллярной стенке соответствует агрегату микрокапсул,образованному капсулами, захваченными магнитным полем. Накоплениекапсул вблизи магнитного наконечника является явным свидетельством ихотклика на внешнее магнитное поле. Согласно измеренному поперечномураспределению магнитного поля внутри капилляра (Рисунок 3.5) капсулыаккумулируются точно в области с наибольшей магнитной индукцией [115–117], которое достигает значения 200 мТл.64100 мкмВмагнит650 мкм60 сек100 мкм51 мкммагнит40 мкм100 мкмкапсулы90 секГмагниткапсулы476 мкмпотоккровиБ30 сек661 мкмстенкакапилляра200 мкл/минА0 сек63 мкм100 мкмкапсулы425 мкмЕ140 сек(50 сек)127 мкмД100 сек(10 сек)63 мкм38 мкм38 мкм100 мкм100 мкмкапсулыкапсулыРисунок 3.6 — Визуализация in vitro микрокапсул, движущихся в потокецельной крови крысы без магнита (a), улавливание капсул с помощьюпостоянного магнита через 30, 60 и 90 с после применения магнитногополя (б-г) и соответственно (д и е) - после удаления магнита.
Капсулыхорошо видны в виде белых областей вблизи стеклянной капиллярнойстенки.Кроме того, количество захваченных капсул может контролироваться магнитным полем, как это показано на флуоресцентных изображенияхрисунка 3.6. Эти данные позволяют нам оценить приблизительное количе-65Количество капсул5x103Магнитное поле«вкл»Магнитное поле«откл»4x1033x1032x1031x103020406080103050100120140Время, секРисунок 3.7 — Количество микрокапсул задержанных магнитным полемство захваченных капсул и следовательно динамику их накопление. Согласно СЭМ-изображениям средний размер капсулы составляет около 3 мкм,что соответствует площади 7 мкм2 .
В свою очередь, площадь агрегатов капсул может быть представлена как сумма прямоугольников и прямоугольныхтреугольников. Таким образом, можно вычислить, что около 2700 капсулбыли захвачены за первые 30 секунд, а затем около 2800 капсул за 60 с идалее около 4500 капсул за 90 секунд магнитного воздействия (рисунок 3.7).После удаления магнита, капсулы почти полностью вымывались изпристеночной области своей первичной локализации (рисунок 3.6д,е и рисунок 3.7).
Однако, после удаления магнита, некоторые отдельные капсулыи их агрегаты могут оставаться на стенке.Магнитный захват микрокапсул in vitro был ранее показан Zebli etal. [118]. В отличии от нашего исследования капсулы захватывались в потоке клеток, а не крови. Также магнитный захват капсул не наблюдался вреальном масштабе времени.
Подобные капсулы могут быть эффективнозахвачены неоднородным магнитным полем в потоке крови и затем могутбыть удалены из места своей локализации после удаления источника магнитного воздействия.663.6 In vivo магнитная адресация магнитных микрокапсул в брыжейкекрысыЭксперименты in vitro в стеклянном капилляре прямоугольного сечения показывают, что капсулы могут быть визуализированны в потоке кровиметодами прижизненной флуоресцентной микроскопии и могут быть локализованы в выбранной области магнитным полем.
Однако эта модель является искусственной и не может в полной мере демонстрировать поведениекапсул в реальном кровеносном русле. Поэтому следующий щаг данной работы был посвящен исследованию захвата капсул in vivo, вводимых в систему кровообращения. Эксперименты in vivo по визуализации и улавливаниюкапсул в кровотоке проводился на сосудах брыжейки: артериолах, венулахи капиллярах.Полиэтиленовыйкатетер с иглойВетви брыжеечнойартерииБрыжейка0,5 мм1 смЗона воздействияТощая кишкаРисунок 3.8 — Фотография брыжейки крысы с указанием ветвей верхнейбрыжеечной артерии, места инъекции и области визуализации сосудистыхсетей и in vivo магнитного захвата микрокапсул.Капсулы вводят непосредственно в ветвь верхней питающей брыжеечной артерии, что увеличивает вероятность обнаружения капсул (рисунок3.8) в сосудах, ответвлённых от данной артерии.67Рисунок 3.9 — Визуализация in vivo и захват микрокапсул в сосудахбрыжейки; (a-в) захвата капсул в Y-разветвленном микрососуде: (a)светлопольное изображение микрососудов (б) флуоресцентый каналвизуализации на длине волны возбуждения 532 нм (в) комбинированноеизображение сосудов и флуоресценции микрокапсул; (г-е) Дополнительныеэксперименты in vivo по захвату капсул в изгибах и бифуркацияхмикрососудистого русла брыжейки (желтые линии на (е) обозначаютстенку микрососуда.68Брыжейка крыс обычно используется в качестве модельной ткани какдля изучения системы кровообращения, так и для анализа микроциркуляторных дисфункций, так как кровоток в брыжеечных микрососудах может быть хорошо визуализирован с помощью оптических систем [119–121].Кроме того, геометрия тощей кишки крысы позволяет установить пару магнитных концентраторов по обе стороны исследуемого сосудистого ветвления.Для экспериментов in vivo используется пара соединённых электромагнитов, которые помещались сверху и снизу ткани брыжейки, аналогично концепции магнитного пинцета, который используется для исследованияклеток [122; 123].
Постоянный магнит заменяется на электромагнит, так какнекоторые хирургические манипуляции должны выполняться после того,как магнит будет установлен в нужной области, и поэтому требуется возможность отключения магнитного поля. Максимальная плотность магнитного поля находится вблизи магнитных наконечников. Это подтверждаютизмерения распределения магнитного поля между полюсами (рисунке 3.10).Наибольшее магнитное поле находится в области, близкой к магнитным наконечникам, и достигает величины около 0,6 Т. Таким образом, капсулыдолжны локализовываться в близи магнитных наконечников.B, ТлY, ммX, ммРисунок 3.10 — Трёхмерное распределение напряжённости магнитногополя в зазоре между концентратарами пары замкнутых электромагнитов.69На рисунке 3.9 показаны изображения микрокапсул, захваченных магнитным полем в разветвлённой сети сосудов брыжейки крысы.
Следует отметить, что в отличие от магнитного захвата in vitro капсулы остаются настенке кровеносных сосудов после выключения магнитного поля. Дальнейшие эксперименты in vivo показывают, что капсулы обычно захватываютсямагнитным полем в изгибах и бифуркациях кровеносных сосудов (рисунок 3.9г-е), где капсула замедляется, попадая в пристеночные потоки плазмы крови, что в свою очередь облегчает их механическое проникновениев стенку сосуда. Это представляется перспективным в отношении магнитной адресной доставки микрокапсул к различным опухолям, поскольку ростраковой ткани всегда сопровождается высокой васкуляризацией, из-за развития новых ангиогенных сосудов [124].Рисунок 3.11 — Типичный гистологический срез брыжейки крысы послемагнитного захвата капсул: (А) стенка вены, отмеченная желтымилиниями; (Б) эритроциты; (В) небольшой капилляр, заполненныймикрокапсулами; (Г) агломерация микрокапсул; (Д) микрокапсулыпредположительно проникшие через эндотелий в стенку вены.Далее, проводился гистологический анализ ткани брыжейки послевведения микрокапсул и воздействия магнитным полем.
На рисунке 3.11 показан типичный образец взятых гистологических фрагментов. Можно четко70различать продольное сечение большой вены, её стенок (А), эритроциты(Б) и небольших капилляров (В). Гистологический анализ показывает накопление микрокапсул вдоль стен больших сосудов, но с сохранением просвета вен. Однако также обнаружено, что капсулы заполняют некоторыенебольшие брыжеечные капилляры (В), хотя количество заблокированныхкапилляров незначительно. Вставка на рисунке 3.11 показывает увеличенный участок стенки вены (е). Видно, что небольшая часть капсул проникает через эндотелий в стенку кровеносного сосуда. Примечательно, чтомагнитная локализация микрокапсул в биоткани не блокирует кровоток вкрупных сосудах, что подтверждается на гистологических срезах (рисунок3.11), и это отчетливо видно во время наблюдений в реальном времени.Это можно объяснить неоднородностью магнитного поля в зазоре междумагнитами, которое притягивают капсулы к противоположным краям сосуда.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
