Диссертация (1144279), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Ряд публикаций показывает, чтовключение магнитных наночастиц в оболочку капсул делает их чувствительными к внешнему градиентному магнитному полю. С этой точки зрениянеоднородное магнитное поле представляется перспективным для концентрирования магнитных микрокапсул, например, вводимых в кровеносныйсосуд, питающий опухоль.В данной главе представлены результаты улавливания in vitro и in vivoфлуоресцентных магнитных микрокапсул в потоке цельной крови.
Для ре-54шения этой задачи была разработана система флуоресцентной визуализации и магнитного захвата, посредством магнитного пинцета, микрокапсул вразветвлённой сети сосудов. В первой части главы рассматривается захватмикрокапсул in vitro , прокачиваемых в потоке крови через искусственныйстеклянный сосуд. Во второй части главы рассматривается захват микрокапсул in vivo, в кровеносном сосуде брыжейки крысы. Было показано, чтокапсулы можно эффективно концентрировать градиентным магнитным полем, оказывающем воздействие ниже по потоку от места инъекции магнитных микрокапсул. Показано, что этот подход является перспективным дляразвития целенаправленных систем доставки и может быть перспективнымв дальнейшем для терапии онкологических заболеваний.3.23.2.1Материалы и методыПротокол синтеза наночастиц 3 4Наночастицы магнетита 3 4 были синтезированы химическим осаждением солей железа (II) и железа (III) в щелочной среде, как описывалMassart [109].
Синтез проводили с помощью автоматизированного реактора,которая обеспечивал точный контроль над количеством реагирующих агентов в камере и сохранял инертную атмосферу во время синтеза [110]. Послесинтеза частицы стабилизировались 0,1 М лимонной кислотой и затем диализовались в воде в течение 4 дней. Путем взвешивания сухого остаткачастиц железа в начальной суспензии было установлено, что концентрацияполученного коллоида составляет 3 мг/мл. Средний размер частиц составлял 12 нм, а дзета-потенциал соответствовал величине -30 мВ.553.2.2Получение RITC-конъюгированного BSAСначала 160 мг BSA растворяли в 40 мл 0,1 М буфера PBS (pH = 8).Затем готовился раствор RITC в этаноле (5 мг/мл). 40 мл раствора BSA добавлялся к 5 мл спиртового раствора RITC при осторожном перемешиваниии затем смесь перемешивали при 40 С в темноте в течение 12 часов.
Наконец, свежеприготовленный RITC конъюгированный с BSA диализовали втечение 3 дней в деионизированной воде.3.2.3Приготовление микрокапсулМикрокапсулы приготавливались посредствам метода последовательного ионного наслоения разнозаряженных полиэлектролитов PAH и PSSна ядрах 3 . Ядра на основе карбоната кальция были синтезированыпри помощи совместного осаждения солей 1M раствора 2 (0,615 мл)и 1M раствора 2 3 (0,615 мл) с добавлением 2,5 мл раствора RITCBSA [45; 51].
Далее на полученные флуоресцентные ядра поочерёдно наносились разнозаряженные слои полиэлектролитов PAH и PSS. Концентрацияводного раствора составляла 1 мг/мл. Для того, чтобы капсулы реагировалина магнитное поле, вместо одного из слоев PSS наносился слой наночастиц 3 4 (0,5 мг/мл), а дополнительные слой RITC-BSA добавлялась к общемучислу слоёв оболочки капсулы для увеличения её общего флуоресцентногосигнала. Затем, матричные ядра растворяли в 0,2 М растворе EDTA (рН 7,3),в результате чего получалась суспензия полых магнитных флуоресцентныхкапсул.
Концентрация полученной суспензии микрокапсул была рассчитанас помощью счетной камеры (гемоцитометр) и составляла 2,45 * 108 мл−1 .563.2.4Конфокальная микроскопияФлуоресцентные свойства микрокапсул исследовались с помощьюинвертированного конфокального микроскопа Leica TCS SP8 X (LeicaMicrosystems). Флуоресценция возбуждалась на длине волны 552 нм, аэмиссия регистрировалось в интервале длин волн 565-700 нм.3.2.5Сканирующая электронная микроскопия (SEM)Измерения СЭМ проводились с помощью микроскопа MIRA II LMU(TESCAN) при рабочем напряжении 30 кВ. Капля суспензии микрокапсулпомещалась на кремневую подложку и высушивалась при комнатной температуре.
Затем образцы были прикреплены к углеродной пластине, приклеенной к алюминиевому держателю исследуемого образца. Далее на поверхность капсул в вакууме напылялись золотые наночастицы.3.2.6Флуоресцентная визуализация микрокапсулОптическая визуализация микрокапсул выполнялась с помощью самодельной оптической установки, которая была спроектирована на базе микроскопа LOMO, оборудованного конденсором светлого поля с белым светодиодным источником света.
Флуоресценция капсул возбуждалась непрерывным лазером на длине волны 532 нм (65 мВт, Lascompany, Россия), который направлялся дихроичным зеркалом в объектив 10x/0,27 (WD = 34 мм,Nanjing KOZO CO., Китай). Чтобы обеспечить равномерную освещенностьпо всему полю зрения, лазерный пучок фокусировался двухлинзовой системой в задней фокальной плоскости объектива.
Сигнал флуоресценции отобразца проходил через дихроичное зеркало и посредствам тубусной лин-57зы (f = 200 мм) фокусировался на детектор CMOS (acA2040-180km, BaslerInc.) с установленным флуоресцентным эмиссионным цветным стекляннымфильтром (OC-14, LOMO). На выходе оптической системы мощность лазерного излучения составляла 24,5 мВт. Схема установки представлена нарисунке 3.1.КМОП камераacA2040-180kmоптический затвортубусная линзаf=200 ммсветофильтрдихроичноезеркалолазерный модуль532 нм, 65 мВтколлиматорзадняя фокальнаяплоскостьобъективаобъектив10x/0.27образецконденсорбелыйсветодиодРисунок 3.1 — Экспериментальная установка3.2.7Системы магнитной адресации микрокапсулДля магнитной локализации микрокапсул in vitro использовался постоянный магнит с заострённой стальной пластиной в качестве концентратора магнитного поля.
Магнитная локализация микрокапсул in vivo проводилось с помощью самодельного электромагнитного пинцета, состоящегоиз двух электромагнитов (Рисунок 3.1). Магниты были собраны из меднойпроволоки, намотанной на катушки со стальными сердечниками. Сердечни-58ки заострялись с одной из сторон, чтобы эффективно концентрировать магнитное поле в целевой области. У каждого электромагнита был отдельныйисточник питания, который позволяет включать электромагниты с разнойполярностью, чтобы наконечники образовали северный и южный полюсасоответственно. Кроме того, сердечники были соединены с незаострённойстороны стальным замыкателем, из того же материала, для увеличения взаимной эффективности магнитов.анит+-атокеиенвлраНапSСтальной замыкательеаниПитмагтрокеэлNЦиркуляциямагнитного полясиловые линиимагнитного поляSСтальнойсердечник+NКатушка-Рисунок 3.2 — Схематическое представление магнитного пинцета для invivo захвата магнитных микрокапсулМагнитное поле в зазоре между наконечниками магнитного пинцета,измерялось с помощью гауссметра FH 51 (Magnet-Physik Dr.
SteingroeverGmbH, Германия). Для постоянного магнита магнитное поле трёхкратно измерялось вдоль оси магнитного диполя с последующим усреднением полученных величин. Для оценки распределения магнитного поля в зазоре59электромагнита измерялись как поперечные, так и осевые составляющиемагнитного поля. Измерения проводились для нескольких плоскостей в зазоре электромагнита.3.2.8Эксперименты in vitroМодель в виде капилляра прямоугольного сечения 2680x200 мкм, через который прокачивалась суспензия микрокапсул и цельной крови крысы, применялась для экспериментов по визуализации и магнитному захвату(постоянный магнит) микрокапсул in vitro в потоке крови.
В частности, 400мкл крови крысы смешивали с 100 мкл суспензии микрокапсул и прокачивали через стеклянную трубочку, предварительно промытую гепарином(Biochemi, Austria 25000 ED/5 мл). Объемный расход полученной суспензииконтролировался с помощью перистальтического насоса IPC Ismatec (ColeParmer GmbH, Германия) и составлял 200 мкл/мин.
Когда трубочка былаполностью заполнена смесью, к стенке трубки подводился постоянный магнит таким образом, чтобы заострённый стальной концентратор касался боковой стенки данной трубочки.3.2.9Эксперименты in vivoIn vivo визуализация и улавливание микрокапсул выполнялись на микрососудах брыжейки крысы. Все процедуры были выполнены в соответствии с «Руководством по уходу и использованию лабораторных животных» [111]. Протокол эксперимента был одобрен Комитетом по уходу и использованию лабораторных животных в Саратовском государственном медицинском университете (протокол H-147, 17.04.2001). Все эксперименты сживотными проводились с использованием общей анестезии (смесь Zoletil,50 мкл, 40 мг/кг (Virbac SA, Carros, Франция) и 2% Rometar, 10 мкл, 10 мг/кг60(Spofa, Чешская Республика)) с помощью внутрибрюшинной инъекции.
Исследование проводили на взрослых самцах белых крыс со средним весом200-250 г. Тощая кишка с брыжейкой вынимались через небольшой разрезбрюшной полости и помещались на предметное стекло. Суспензию микрокапсул вводили в отделение верхней брыжеечноя артерии (диаметр около0,5 мм) через тонкую полиэтиленовую трубку (внутренний диаметр 0,28 мм(ID), наружный диаметр 0,61 мм (OD), Portex, Smiths Medical InternationalLdt., UK) с иглой из нержавеющей стали на конце (OD 0,33 мм).
Игла былапрочно закреплена, чтобы избежать повреждения сосуда острым стальнымкраем. Перед имплантацией трубку заполняли изотоническим (0,15 М) водным раствором NaCl. Перед инъекцией суспензия капсул разбавлялась в3 раза для уменьшения вероятности тромбических сосудистых реакций идобавлялись в 0,15 М раствор NaCl.
Суспензию вводилась порциями порядка 0,1 мл. Для повышения вероятности обнаружения капсул общий объеминъекций составлял 0,5 мл. Для захвата in vivo два электромагнита былиустановлены в непосредственной близости от выбранной области брыжейки таким образом, чтобы визуализированные сосуды располагались в зазоремежду двумя магнитными концентраторами. Зазор между магнитными концентраторами составлял 2 мм. Магнитное поле включалось непосредственно перед инъекцией капсул.
Обе электромагнита были рассчитаны на ток0,5 А и 25 В.3.2.10Гистологический анализГистологический анализ проводили для определения топографии микрокапсул в тканях и сосудах брыжейки. Для гистологического исследованияживотных умерщвляли в конце эксперимента, а области исследуемой тканибрыжейки фиксировали в 10% (объемном) растворе формалина в течение24 часов. Образцы, фиксированные формалином, фиксировали в парафин,(толщина среза 5 мкм) и окрашивали гематоксилином и эозином. Кроме того, гистологические срезы исследовали с помощью световой микроскопии.613.3Результаты и обсуждение3.4Синтез микрокапсулPSSАБPAHRITC-BSAPSSx3PAHМагнетитPAHRITC-BSAPAHКапсулированныйRITC-BSA30 мкмРисунок 3.3 — Схематическое представление структуры оболочкимагнитных флуоресцентных микрокапсул (а) и их конфокальноеизображения (б)На рисунке 3.3а показана структура оболочки магнитных микрокапсул.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
