Диссертация (1144279), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Были показаны этапы изготовления и герметизации многослойных самоорганизующихся ПТМП(PSS/PDADMAC)40 с использованием технологии микропечати. Размерыи форма микроконтейнеров ПТМП зависят от параметров кремниревоймастер-маски и как следствие, в зависимости от выбранной мастер-маски,возможно варьировать объёмы микроконтейнеров ПТМП, от десятков кубических нанометров до кубических миллиметров. В результате подобнаясистема может быть носителем как для водорастворимых низкомолекулярных химических соединений, так и для целых полимерных систем(микрокапсулы).Лазерно-инициированные фототермическае активация ПТМП проводились в сухом виде, в деионизированной воде и в 1% агарозном геле скрасителем FITC.
При фототермической активации ПТМП наблюдалосьплавление полиэлектролитов, вплоть до сквозного повреждения ПТМП.При фототермической активации ПТМП в деионизированной воде, наблюдались паттерны изотермического повреждения ПТМП, такие каксжатие, скручивание, разрыв и расслоение полиэлектролитных слоёвПТМП.
При фототермической активации ПТМП с инкапсулированнымRhB, в 1% агарозном геле, окрашеном FITC, наблюдались как эффектыплавления полимерной плёнки, так и эффекты разрыва и расслоенияПТМП. В результате наблюдался выход RhB красителя из изолированныхмикроконтейнеров ПТМП в окружающую среду (фантом мягких тканей),что было подтверждено посредствам флуоресцентной конфокальной 3Dреконструкции области лазерного воздействия ПТМП.102По перспективам данные плёнки могут переменяться для покрытияповерхностей титановых костных имплантов, для фототермической активации пролонгированной антибактериальной терапии.103Глава 6. In situ опосредованная ИК-лазерная адресация биологическиактивных веществ для экспрессии зелёного флуоресцентного белка уединичных клеток на основе биосовместимых полимерных трёхмерныхмикроструктурированных плёнок6.1ВведениеПТМП обеспечивает контролируемую инкапсуляцию химически активных компонентов в виде небольших кластеров, равномерно распределённых по поверхности полимерной плёнки.
Полимерные плёнки находятсвоё применение не только для контролируемой доставки лекарственныхсредств, но и в качестве антикоррозионных покрытий, для задач микроэлектроники, тканевой инженерии и сохранения продуктов питания [135]. Целью данной работы было использование ПТМП плёнки в качестве клеточного субстрата, для задач экспрессии специфических доксициклин-зависимыхгенов ЗФБ, единичных модифицированных клеток С2С12, посредствам целевой фототермической активации уединённых микроконтейнеров ПТМП синкапсулированным доксициклином (DOX). В результате ЗФБ модифицированные клетки С2С12, после воздействия DOX активируют экспрессиюЗФБ посредствам тетрациклин-зависимого промоутера ( ), активированного rtTA-2SM2, который в свою очередь активно отключается в отсутствиеDOX путём связывания репрессора tet-R-KRAB [136].В данном разделе представлены ПТМП на основе биополимера PLA,изготовленные посредством микропечати.
PLA является биоразлогаемым,химически нейтральным, гидрофобным веществом, что позволяет, с егопомощью, изготавливать герметичные ПТМП, способные инкапсулироватьнизкомолекулярные (MW <1000) компоненты. Однако структура и свойстваPLA снижают адгезию клеток к поверхности полимерного субстрата, чтонегативно сказывается на культивировании клеток на поверхности ПТМП.Для решения этой проблемы поверхность ПТМП модифицировалась слоемколлагена, который повышает гидрофильные свойства ПТМП и специфиче-104ски взаимодействует с поверхностными клеточными рецепторами [137;138].Между слоем коллагена и биополимерной ПТМП наносился слой наночастиц золота, посредствам ионного напыления в вакууме, для возможностифототермической активации единичных микроконтейнеров ПТМП.Основным методы высвобождения инкапсулированного агента из биополимерных носителей основываются на элюировании, которое вызываетпостоянное высвобождение лекарственных веществ, благодаря биодеградации полимерных систем [139].
В предыдущих работах по контролируемому высвобождению капсулированных веществ из полимерных матриц,использовались такие методы активации, как магнитные поля, электрическое воздействие, механическое воздействие, биодеградация, диффузия иизменение pH [25; 140; 141]. Также была показана возможность активациидисперсных полимерных систем лазерным ИК излучением в границах оптического окна прозрачности биоткани, для задач терапии раковых новообразований [142–144]. Золотые наночастицы широко применяются для биомедицинских задач лазерной фототерапии, клеточной трансфекции и активации полимерных носителей [145].
Поверхностный плазмонный резонанс- это когерентное возбуждение всех свободных электронов в пределах зоны проводимости. В случае, если плазмонные колебания, возбуждаемые вразных частях наночастицы, интерферируют конструктивно, возникает явление плазмонного резонанса. При этом существенно возрастает величинасечения экстинкции электромагнитной волны. Положение пика в спектре,а также его величина, существенно зависят от формы частицы и ее размера [146; 147]. Основным достоинством плазмонных ЗНЧ является способность эффективно поглощать электромагнитные излучения и преобразовывать его в тепловую энергию в видимой и ближней ИК спектральной области, локально повышая температуры в прилегающей к наночастице пространству.
Поэтому достигается возможность применять ЗНЧ совместно слазерными системами в спектральной области оптического окна прозрачности биологических тканей [148]В настоящее время проблема адресации биологически активных веществ к единичным клеткам, посредствам модифицированного клеточногосубстрата, является нерешённой. В данной работе была реализована ме-105тодика инкапсуляции небольших гидрофильных молекул флуоресцентногокрасителя родамин Б и биоактивного антибиотика (DOX) в индивидуальные микроконтейнеры ПТМП. Контролируемая фототермическая активацияединичных микроконтейнеров ПТМП позволяет адресовать биологическиактивные вещества к единичным клеткам-мишеням в пределах клеточнойколонии.Эффективность доставки биологически активные веществ к единичным клеткам оценивалась посредствам регистрации флуоресцентногосигнала ЗФБ генетически модефицированных клеток-мишеней после активации микроконтейнеров ПТМП.
Достоверность активации микроконтейнера ПТМП определялось относительно пространственного распределениясигнала инкапсулированного флуоресцентного красителя RhB.1066.26.2.1Материалы и методыИзготовление полимерной трёхмерной микроструктурированнойплёнкиРисунок 6.1 — Схематическое представление основных этапов синтеза PLAбиополимерной ПТМП посредством метода микропечати (а), СЭМизображения пустой негативной PLA матрицы, до процесса микропечати(б), СЭМ изображения PLA матрицы, до процесса микропечати, спреципитированными кристаллами доксициклина (в), пустая ПТМПплёнка с С2С12 клеточной колонией (г), ПТМП плёнка с доксициклином ис С2С12 клеточной колонией (д)107Для изготовления ПТМП с массивом пустых микроконтейнеров, использовался биополимер PLA (гранула 3 мм, Mw ≈ 60 000, Sigma-Aldrich,Германия).
Биополимер PLA растворяли в 1, 2, 3 и 5 %мас. в хлороформе.Негативный ПДМС штамп быстро погружался на 5 с в раствор PLA припомощи CO2 газовой подвижки. Скорость погружения составляла 80 мм/с.Извлечение ПДМС штампа из раствора PLA осуществлялось за счёт перемещения линейной подвижки шаговым двигателем, со скоростью 0,05-4мм/с.
Далее, трёхмерные ячейки, полученной PLA плёнки, загружались биологически активными компонентами посредствам ко-преципитации и затемпечатались на поверхность покровного стекла, обработанного по той жетехнологии, биополимером PLA. Ко-преципитация карго веществ производилась путём погружения ПДМС штампа со слоем PLA в водные растворыRhB (0,2 мг/мл) или DOX (10 мг/мл), при ультразвуковом воздействии втечение 30 с, при частоте 37 кГц, мощности 0,087 Вт/см2 Elmasonic 15H(Elma Schmidbauer GmBH, Singen, Германия). Затем с поверхности образцаубиралась лишняя влага безворсовой салфеткой, для предотвращения образования кристаллов RhB или DOX в пространстве между несущими ячейками.
Количество загруженного вещества в единичный микроконтейнер полимерной трёхмерной PLA плёнки составило 12,5± 6 пг флуоресцентногокрасителя RhB или 2± мкг активного вещества на 1 см2 (160.000 микроконтейнеров). Для того, чтобы 3D плёнку возможно было активировать ИКлазерным излучением, на поверхность ПТМП напылялись в вакууме золотые наночастицы (SC 7620, Quorum, Laughton, Великобритания).6.2.2Клеточная линия миобластов С2С12Клетки C2C12 были подготовлены с помощью лентивирусной инфекции, чтобы экспрессировать репрессор тетрациклина (TetR-KRAB) [149] иактиватор (rtTA-2SM2) [136] из одной экспрессионной кассеты [150] в дополнение к EGFP от реагирующего с тетрациклином промоутера, как былоописано [16; 151].1086.2.3 Культивация миобластов С2С12 на внешней поверхностиполимерной тёхмерной микроструктурированной плёнкиПоверхность 3D плёнки, покрытая золотыми наночастицами, модифицировалась слоем раствора PEI (2 мг/мл, при концентрации соли (NaCl) 0,5М), для создания первичного якорного слоя, с большой плотностью положительных зарядов на поверхности ПТМП.
Затем ПТМП трижды промываласьв деионизированной водой, для удаления всех неадсорбированных макромолекул с поверхности пПТМП последующим погружением образца на 1час в коллаген (0,5 мкг/мл в растворе PBS). Затем ПТМП стерилизоваласьультрафиолетовым светом в течение 20 минут. Клетки миобластов крысыC2C12 были получены из Европейской коллекции культур клеток животных (ECACC, Porton Down, Великобритания). Клетки культивировались вDMEM с добавлением 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина при 5%CO2 и темпиратуре 37 0 C.
Клетки высевались вз 4-луночный планшет, вколичестве 1х104 клеток на лунку, на внешнюю поверхность полимернойPLA 3D плёнки, которая предварительно помещалась на дно каждой лункиклеточного планшета. Далее клетки инкубировались 24 часа.6.2.4Окрашивание клеток С2С12Клетки миобласта C2C12 трижды промывали в PBS, фиксировалив параформальдегиде (4%, 10 мин) и пропитывали Triton X-100 (0,2%, 5мин). Затем клетки инкубировали в TRITC-Phalloidin (1: 1000) и DAPI (4,6диамидино-2-фенилиндол, 1: 1000).
Клетки выдерживали в PBS при комнатной температуре в течение 1 часа. Клетки миобласта окончательно промывали снова три раза в PBS и далее инспектировали с помощью флуоресцентного микроскопа Leica DMI4000.1096.2.5Хорактеризация полимерной тёхмерной микроструктурированнойплёнкиСЭМ изображения полимерной PLA 3D плёнки были получены с помощью электронного микроскопа FEI Quanta ESEM (FEI, Hillsboro, США).Ускоряющее напряжение составляло 10 кВ, размер пятна 3,5, а рабочее расстояние составляло 10 мм. Перед СЭМ-визуализацией, на образцы напылялись частицы золота в вакууме.
Толщина слоя золота составляла порядка 10 нм, при времени напыления в 45 с, для обеспечения проводимости.ПТМП микроконтейнеры визуализировались при помощи инвертированного флуоресцентного микроскопа (Olympus IX-71, Olympus, Токио, Япония).Моделирование фототермического нагрева и тепловой диссипации внутриединичного микроконтейнера ПТМП было произведено при помощи программного пакета Comsol Multiphysics 4.3a, (Comsol, Стокгольм, Швеция).6.2.6ВизуализацияФлуоресцентная визуализация, а также лазерная активация ПТМПплёнки производилась при помощи инвертированного флуоресцентногомикроскопа Olympus IX-71.
Культивация С2С12 клетк на внешней поверхности ПТМП производилось в стандартном стеклянном клеточном планшете. Для лазерной активации единичных ПТМП микроконтейнеров применялся лазерный ИК диод (LD830-MA1W, длина волны 830 нм, Thorlabsinc., США), как показано на рисунке 6.2. Расходящийся лазерный луч коллимировался асферической линзой f = 4,51 мм (A230TM-B, Thorlabs inc.,Germany). После 3х расширения коллимированного лазерного луча паройанаморфных призм (PS879-B, Thorlabs inc., США), лазерный луч направлялся перископической системой в задний порт микроскопа с параллельным ходом лучей. Затем лазерный ИК луч, отражённый дихроичным зеркалом (DMSP805, Thorlabs inc., США), фокусировался объективом микроско-110Рисунок 6.2 — Схематическое изображение фототермической активациимикроконтейнеров ПТМП, сфокусированным лазерным ИК пучком, надлине волны 830 нм, для локального высвобождения инкапсулированногодоксициклина возле тетрациклин-зависимой клетки-мишени споследующей экспрессии ЗФБ.па FUC LUN Plan FLX 60х/0,7 Ph2 (Olympus, Токио, Япония) на поверхности ПТМП в пятно диаметром 1 мкм.Возбуждение флуоресценции ЗФБ производилось при помощи галогенной лампы (Lumen 200, Prior Scientic, Inc., США) и стандартного набора светофильтров (куба U-MNIB) для регистрации флуоресценции ЗФБ(Фильтр возбуждения флуоресценции 470-490 нм, дихроичное зеркало 505нм и барьерный фильтр эмиссии 515 нм, Olympus, Токио, Япония).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
