Диссертация (1141412), страница 20
Текст из файла (страница 20)
Расчетсодержания суммы флавоноидов вели по удельному показателю поглощения лютеолин-7гликозида с раствором алюминия хлорида.D0,620,50,410,30,20,137 0390410430450λ, нмРисунок 60 – Дифференциальные спектры поглощения спирто-водного извлечения изтравы кульбабы осенней с алюминия хлоридом (1) и цинарозида с алюминия хлоридом (2) ввидимой области спектраПри разработке методики раствором сравнения служило спиртовое извлечение бездобавления алюминия хлорида. Таким образом, нами была достигнута возможностьнивелировать влияние на результаты анализа веществ, обладающих оптической плотностью вобласти максимума поглощения цинарозида с раствором алюминия хлорида [45, 91, 192].В ходе количественного определения в исследуемые извлечения добавляли кислотууксусную разведенную для удержания флавоноидов в недиссоциированной форме для улучшения воспроизводимости результатов эксперимента [45, 91].Максимум оптической плотности наблюдается через 30 минут после протекания реакциикомплексообразования и сохраняется в течение 90 минут, что является достаточным дляпроведения количественного определения (таблица 19).Таблица 19 – Время устойчивости спирто-водного извлечения из травы кульбабыосенней с раствором алюминия хлоридаВремя, минОптическая плотность (λ= 395 нм)150,7416300,7956600,7917900,76661200,7492Таким образом, нами была разработана методика количественного определения суммыфлавоноидов в траве кульбабы осенней.1034.3.2 Методика количественного определения суммы флавоноидовОколо 1,0 г (точная навеска) сырья, проходящего сквозь сито с диаметром отверстий 1мм, помещают в колбу с притертой пробкой, объемом 250 мл.
Сырье заливают 100 мл спиртаэтилового 70% и взвешивают с погрешностью ±0,01 г.Колбу присоединяют к обратному холодильнику и помещают на кипящую водянуюбаню на 45 минут. Колбу время от времени взбалтывают, чтобы смыть частицы сырья состенок. После чего колбу с извлечением охлаждают под струей проточной воды, вытираютдосуха и взвешивают, при необходимости массу доводят до первоначальной спиртом этиловым70%.
Охлажденное и доведенное до первоначальной массы извлечение фильтруют черезбумажный фильтр, при этом отбрасывают первые 10 мл фильтрата, необходимых длясмачивания фильтра. Из полученного экстракта берут 10,0 мл фильтрата, которые помещают вмерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 2 мл раствора алюминия хлорида 2%,растворенного в спирте этиловом 70%. Через 10 минут – 2 капли кислоты уксуснойразведенной. Спиртом этиловым 70% доводят объем раствора до метки.Через 30 минут измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре придлине волны 395 нм в кювете с толщиной рабочего слоя 10 мм.В качестве раствора сравнения используют раствор, содержащий те же компоненты, чтои анализируемый раствор, но без добавления алюминия хлорида.
Таким образом, растворсравнения состоит из 10 мл отфильтрованного извлечения, 2 капель разведенной уксуснойкислоты и спирта этилового 70%, необходимого для достижения конечного объема, равного 25мл.Содержание суммы флавоноидов в процентной концентрации (Х) в пересчете нацинарозид вычисляют по формуле: ∗ 100 ∗ 100 ∗ 100,(9)345 ∗ ∗ ∗ 4 ∗ (100 − )где D –оптическая плотность анализируемого раствора при длине волны 395 нм;Х=345 – удельный показатель поглощения цинарозида с алюминия хлоридом в 70% спиртеэтиловом;V – объем извлечения в мл;m – масса навески сырья в граммах;W– влажность сырья, %1044.3.3 Результаты валидации методики количественного определения суммы флавоноидовв траве кульбабы осеннейВалидационныеопределениясуммыисследованияразработаннойнамиметодикифлавоноидов в траве кульбабы осеннейколичественногопроводили,используяобщепринятые критерии [44, 66, 107, 150].
Первоначально готовили исходный раствор (0,05%),а затем для оценки линейности готовили растворы ГСО цинарозида в шести различныхразведениях, согласно методике, приведенной на рисунке 61.На основе полученных экспериментальных данных нами был построен калибровочныйграфик цинарозида, представленный на рисунке 62.Мерная колба на 25 млВносимый объем 0,05%раствора ГСО цинарозида:0,25, 0,50, 0,75, 1,00, 1,25, 1,502 мл раствора алюминияхлорида 2% в спиртеэтиловом 70%2 капли кислоты уксуснойразведеннойСпирт этиловый 70% до метки(25 мл)30 минИзмерение оптическойплотностиПостроение градуировочногографикаУсловия спектрофотометрии:длина волны - 395 нмтолщина рабочего слоя - 10 ммконтроль - раствор сравнения бездобавления раствора алюминияхлоридаРисунок 61 - Методика определения оптической плотности растворов ГСО цинарозидаразличной концентрации105D 1,210,80,60,40,200,00050,0010,00150,0020,00250,003C, мг/млРисунок 62 – Зависимость оптической плотности растворов цинарозида с алюминияхлоридом от концентрации цинарозидаУстановление репрезентативности разработанной методики по показателю линейностипроводили с помощью расчета коэффициента корреляции.
В ходе статистической обработкинаряду с коэффициентом корреляции также рассчитывали общепринятые параметры линейнойрегрессии, значения которых отражены в таблице 20.Таблица 20 – Результаты статистической обработки данных, полученных при изучениилинейной зависимости вида y = bx + aF5x0,002y0,603b378,703a-0,060R0,999Значение коэффициента корреляции составляет 0,999, что подтверждает возможность ирациональность использования разработанной методики для количественного определениясоединений флавоноидной природы в траве кульбабы осенней методом дифференциальнойспектрофотометрии в пересчете на цинарозид в установленном диапазоне концентраций.С целью определения диапазона использования разработанной методики проводилиспектрофотометрическоеопределениеоптическойплотностиспиртовыхрастворов,полученных из навесок травы кульбабы осенней массой 0,4, 0,6, 0,8, 1,0, 1,2 г (точные навески).Извлечения разбавляли, для этого в мерные колбы объемом 25 мл вносили по 10 мл каждого изполученных извлечений, затем последовательно прибавляли по 2 мл раствора алюминияхлорида 2%, приготовленного на спирте этиловом 70%, по 2 капли кислоты уксуснойразведенной.
После перемешивания полученных растворов, их доводили до метки спиртомэтиловым 70%. Растворы вновь перемешивали и выдерживали в течение 30 минут с цельюполного образования окрашенных комплексов. Затем проводили спектрофотометрическоеопределение оптической плотности исследуемых растворов при длине волны 395 нм, в кювете106с толщиной рабочегослоя 10 мм с использованием раствора сравнения.
Основываясь наполученных данных был построен градуированный график, который показан на рисунке 63.D 1,210,80,60,40,200,40,60,811,2m, гРисунок 63 – Зависимость оптической плотности извлечений из сырья с алюминияхлоридом от массы навески травы кульбабы осеннейУстановление репрезентативности разработанной методики по показателю диапазонаиспользованияпроводилиспомощьюрасчетакоэффициентакорреляции.Входестатистической обработки наряду с коэффициентом корреляции также рассчитывалисьобщепринятые параметры линейной регрессии, значения которых отражены в таблице 21.Таблица 21 – Результаты статистической обработки данных, полученных при изучениилинейной зависимости вида y=bx+aF4x0,801y0,605b0,749a0,005R0,999Значение коэффициента корреляции составляет 0,999, что подтверждает возможность ирациональность использования разработанной методики для количественного определениясоединений флавоноидной природы в траве кульбабы осенней методом дифференциальнойспектрофотометрии в пересчете на цинарозид в установленном диапазоне концентраций.Для подтверждения повторяемости разработанной методики нами анализировался одинобразецсырьякульбабыосеннейвшестиповторностях.Полученныерезультатыколичественного содержания флавоноидов кульбабы осенней статистически обрабатывали сцелью определения значения относительного стандартного отклонения (норма допустимыхотклонений 10%).
Данный статистический параметр является критерием приемлемостипоказателя повторяемости, значение которого в результате проведения нашего экспериментасоставило 4,70% (таблица 22).107Таблица 22 – Результаты определения содержания суммы флавоноидов в сырьекульбабы осенней методом дифференциальной спектрофотометрии№п/п123456Содержание суммыфлавоноидов0,650,640,640,620,630,65ВоспроизводимостьМетрологические характеристикиxср=0,64Sx2=0,00014Sxср=0,0118Δx=0,03Eотн=4,70xср±Δxср=0,64±0,03разработаннойметодикиподтверждалипутемпроведенияколичественных испытаний трех образцов сырья кульбабы осенней двумя исследователями втрех повторностях (таблица 23).
Полученные результаты количественного содержанияфлавоноидов в сырье кульбабы осенней статистически обрабатывали с целью определениязначения относительного стандартного отклонения (норма допустимых отклонений 15%).Прецизионность разработанной методики определения содержания флавоноидныхсоединений относительно параметра воспроизводимости подтверждена количественнымзначением относительного стандартного отклонения (в условиях нашего эксперимента 6,98%).Таблица 23 – Определение воспроизводимости методикиПовторностьАналитик112131425262Среднее значениеОтносительное стандартноеотклонение, (RSD%)Содержание суммы флавоноидов в пересчете нацинарозид в траве кульбабы осеннейОбразец №1Образец №2Образец №30,660,700,560,630,720,540,640,740,550,640,710,560,670,740,570,650,690,550,650,720,566,176,985,41Для подтверждения правильности методики проводили количественное определениесуммы флавоноидов в пересчете на цинарозид в растворах, которые получали путемприбавления известного количества стандартного раствора цинарозида.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
