Диссертация (1141412), страница 21
Текст из файла (страница 21)
В исследуемоеизвлечение из травы кульбабы осенней вносили по 0,25 мл, 0,5 мл, 0,75 мл стандартногораствора цинарозида.108Таблица 24 – Определение правильности методики№п/п123456789Содержаниесуммыфлавоноидов впересчете нацинарозид, мг0,6400,6400,6400,6400,6400,6400,6400,6400,640ДобавленоГСОцинарозида,мгОжидаемоесодержание,мгПолученноесодержание,мг0,1250,7650,1250,7650,1250,7650,2500,8900,2500,8900,2500,8900,3751,0150,3751,0150,3751,015Среднее значение выхода 100,17%Относительная ошибка 4,37%Значениевыхода,%0,7430,7680,7520,8850,9100,9121,0221,0361,00397,12100,3998,3099,44102,25102,47100,69102,0798,82СтатистическиехарактеристикиХср=100,17S2=3,59S=1,89∆Х=4,38Еотн=4,37В качестве критерия приемлемости использовали среднее значение количественноговыхода суммы флавоноидов, скорректированное на 100% (диапазон допустимых отклонений100±5%) [66].Полученные нами значения выхода суммы флаваноидов в сырье кульбабы осеннейукладываются в интервал от 97,12% до 102,47% (таблица 24).
При этом средняя величинавыхода составила 100,17% при относительной ошибке определения 4,37%.Таким образом, нами проведена валидация разработанной методики количественногоопределения соединений флавоноидной природы в сырье кульбабы осенней.4.3.4 Содержание суммы флавоноидовв траве кульбабы осенней и кульбабы шершавоволоситойНа основе разработанной методике было установлено содержание флавоноидов в травекульбабы осенней и кульбабы шершавоволосистой, заготовленной в различных местахпроизрастаниях (таблица 25).109Таблица 25 – Содержание суммы флавоноидовв траве кульбабы осенней и кульбабышершавоволосистой (n = 5, P= 95%)Место сбора сырьяМетрологическая характеристика методикиХ, %S2SΔХEотн,%Кульбаба осенняяКурская обл., окрестности0,550,000070,00840г.
Курска 2013 г.Белгородская обл. окрестности0,710,000130,01140г. Белгорода 2013 г.Воронежская обл. окрестности0,660,000130,01140г. Воронежа 2014 г.Кульбаба шершавоволосистаяКурская обл., окрестности г.0,740,000100,01000Курска 2013 г.Белгородская обл. окрестности0,780,000130,01140г. Белгорода 2013 г.Воронежская обл. окрестности0,830,000170,01300г. Воронежа 2014 г.0,023,640,034,230,034,550,034,050,033,850,044,82Анализ данных, представленных в таблице 25, позволил установить норму содержаниясуммы флавоноидов для растений рода кульбаба – не менее 0,5%. Ошибка методикиколичественного определения суммы флавоноидов с 95% вероятностью не превышает 4,82%(таблица 25).4.4 Результаты количественного определения полисахаридовДругим классом биологически активных веществ широко применяемым в медицинскойпрактике и содержащемся в растениях рода кульбаба являются полисахариды. В связи с чем,нами разработана методика их количественного определения.Полисахаридысдавнихвременширокоприменяютсякакобволакивающие,мягчительные и отхаркивающие средства [93, 130].
В настоящее время установлен широкийспектр их фармакологической активности.Показана перспектива использования полисахаридов в кардиологии. Так, установленаантикоагулянтная активность производных хитозана и фуконаида в эксперименте in vitro [172].Экспериментальные исследования на животных и клинические наблюдения на людяхдоказывают, что некрахмальные полисахариды снижают такой важный фактор риска сердечнососудистых заболеваний, как уровень холестерина в сыворотке крови [172].110Уотдельныхполисахаридоввыявленоантибактериальное,противовирусноеииммунотропное действие [129, 132, 172 ,240].Имеются сведения об их противоопухолевой активности [129]. Способность повышатьработоспособность, определило применение полисахаридов в спортивной медицине [122, 129].Содержание полисахаридов в растительном сырье и препаратах на их основе определяютгравиметрическими [51, 62, 92, 171], спектрофотометрическими [118] и хроматографическимиметодами [204].
В настоящее время появляются публикации, в которых для определенияполисахаридногосоставаприменяютгазовуюхроматографиюсмасс-спектральнымдетектором. Данная методика, а также совместное применение масс-спектрометрии с ВЭЖХпозволяютразделить,идентифицироватьиопределитьколичественноесодержаниекомпонентов смеси полисахаридов [209, 213, 218]. В литературе описан метод анализаполисахаридов с использованием ГЖХ [204].Несмотря на обилие методов количественного определения полисахаридов, наиболеераспространенным методом анализа растительного сырья, содержащего полисахариды,является гравиметрический метод [62], основанный на извлечении суммы полисахаридов изсырья с последующим осаждением их спиртом этиловым 96%.4.4.1 Результаты изучения условий гравиметрического определения суммыполисахаридовДля анализа травы кульбабы осенней и кульбабы шершавоволосистой нами предложенаметодика гравиметрического определения полисахаридов.
Разработку методики проводили насырье кульбабы осенней.При этом изучены следующие стадии:− количественное извлечение суммы полисахаридов;− подбор оптимальных условий осаждения полисахаридов.На количественный выход полисахаридов из растительных клеток оказывает влияниетакие факторы как степень измельчения сырья, природа экстрагента, время и температураэкстрагирования, соотношение массы сырья и объема экстрагента.Размер частиц лекарственного сырья оказывает влияние на процесс переходабиологически активных веществ из растительных клеток в среду растворителя. Для различныхвидов сырья установлены оптимальные значения измельченности. Результаты проведенного111нами изучения влияния степени измельчения сырья на извлечение суммы полисахаридовотражены в таблице 26.Таблица 26 – Влияние степени измельченности травы кульбабы осенней на выход суммыполисахаридовСтепень измельчения сырья, мм123Содержание суммы полисахаридов, %9,68±0,294,68±0,174,05±0,11Максимальный выход полисахаридов из травы кульбабы осенней достигается прииспользовании сырья со степенью измельченности 1 мм.В качестве экстрагента, используемого для извлечения полисахаридов, применяется водаочищенная [92].
Нами применялась экстракция из сырья со степенью измельчения частиц 1 ммпри соотношении массы сырья к объему растворителя 1:10. Полученные данные отражены втаблице 27. На основании данных приведенных в таблице 27 следует, что при проведениичетырехкратной экстракции растительного сырья (4 раза в течении 30 минут каждый)происходит количественный выход полисахаридов.Таблица 27 – Зависимость содержания суммы полисахаридов от времени экстракциитравы кульбабы осенней (степень измельчения 1 мм)Время экстрагирования, мин.3060 (30х2)90 (30х3)120 (30х4)Содержание суммы полисахаридов, %4,23±0,136,16±0,179,19±0,289,68±0,29В качестве осадительного реактива полисахаридов из водных растворов широкоприменяется спирт этиловый 96% [62, 92].Нами выявлено оптимальное объемноесоотношение водного извлечения из растительного сырья и спирта этилового 96%,позволяющее проводить полное осаждение полисахаридов содержащихся в водном извлечении.Полученные в ходе эксперимента данные представлены в таблице 28.Таблица 28 – Зависимость полноты осаждения суммы полисахаридов от объема спиртаэтилового 96%Соотношение извлечения и спиртаэтилового 96%1:11:21:31:4Содержание суммы полисахаридов, %3,89±0,146,60±0,249,68±0,299,77±0,24112На основании данных, отраженных в таблице 28, можно сделать вывод, чтомаксимальное осаждение полисахаридов, содержащихся в водных извлечениях, полученных изтравы кульбабы осенней, осуществляется при добавлении трехкратного объема спиртаэтилового 96%.На основе полученных ранее экспериментальных данных нами предложена методикаколичественного определения полисахаридов в траве кульбабы осенней.4.4.2 Методика количественного определения суммы полисахаридовОколо 10,0 г (точная навеска) измельченного до размера частиц, проходящих сквозь ситос отверстиями размером 1 мм сырья кульбабы осенней, помещают в колбу объемом 250 мл,добавляют 100 мл воды очищенной, колбу помещают на электрическую плитку соединяют собратнымводянымхолодильником,кипятятприпериодическомперемешиваниинапротяжении 30 минут.
Экстракцию проводят еще трижды, каждый раз прибавляя 100 мл водыочищенной и кипятят в течение 30 минут каждый раз.Полученные таким образом водные извлечения объединяют и центрифугируют счастотой вращения 5000 об/мин в течение 10 минут. После чего водное извлечение переносятчерез пять марлевых слоев, вложенных в стеклянную воронку, предварительно смоченныхводой очищенной в мерную колбу объемом 500 мл. Фильтр промывают водой очищенной идоводят объем раствора водой до 500 мл (раствор А).25 мл раствора А переносят в центрифужную пробирку, в которую добавляют 75 млспирта этилового 96%. Полученную смесь перемешивают, подогревают при температуре 60 Сна водяной бане на протяжении 5 минут.
Через 30 минут содержимое центрифугируют счастотой вращения 5000 об/мин в течение 30 минут. Надосадочную жидкость фильтруют припониженном давлении (13-16 кПа) через высушенный в сушильном шкафу при температуре100-1050С до постоянной массы стеклянный фильтр ПОР 16 диаметром 40 мм. Полученныйосадок количественно переносят на этот же фильтр и промывают 15 мл смеси спирта этилового96% и воды очищенной (4:1). Фильтр с осадком высушивают сначала на воздухе, затем притемпературе 100-1050С в сушильном шкафу до установления постоянной массы.113Содержание полисахаридов в пересчете на абсолютно сухое сырье в процентах (Х)вычисляют по формуле: =где m1 – масса фильтра, г;(2 − 1 ) ∗ 500 ∗ 100 ∗ 100, ∗ 25 ∗ (100 − )(10)m2 – масса фильтра с осадком, г;m – масса сырья, г;W – потеря в массе при высушивании сырья, %.4.4.3 Результаты валидации методики количественного определения суммыполисахаридов в траве кульбабы осеннейВалидацию методики количественного определения суммы полисахаридов проводили пообщепринятым критериям [44, 107, 150].Установлениепоказателялинейностипроводиливизвлеченияхсразличнойконцентрацией.
С этой целью в соответствии с разработанной методикой получали извлеченияиз навесок массой 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 и 10,0 г (точные навески) и определяли в них содержаниеполисахаридов. На основе полученных данных был построен градуировочный график,представленный на рисунке 64.На основании полученных результатов установлено, что в пределах измеряемыхконцентраций зависимость содержания полисахаридов от массы навески сырья носит линейныйхарактер (рисунок 64 и таблица 29).м, г12100,042180,033560,025440,016820,0085000,010,020,030,040,05С, мг/млРисунок 64 – Зависимость содержания суммы полисахаридов от массы навески сырьякульбабы осенней114Таблица 29 – Результаты статистической обработки данных, полученных при изучениилинейной зависимости вида у = bx + aFbaRх40,0336,001181,0270,1170,999При определении повторяемости методики критерий приемлемости составил 4,03 %(таблица 30), что свидетельствует о прецизионности методики в условиях повторяемости.Таблица 30 – Содержание суммы полисахаридов в траве кульбабы осенней№п/п123456Содержание полисахаридов, %Метрологические характеристикиХср=9,69Sx2=0,02Sxcp=0,15∆x=0,39Eотн=4,03Хср+∆xср=9,69 + 0,399,549,869,669,599,579,89Воспроизводимость определяли 2 аналитика на 3 образцах в 3 повторностях.Относительное стандартное отклонение не превышало6,95,чтосвидетельствуетопрецизионности методики в условиях воспроизводимости (таблица 31).Таблица 31 – Определение воспроизводимости методики количественного определениясуммы полисахаридов в траве кульбабы осеннейПовторностьАналитик112131425262Среднее значениеПогрешность измерения (∆Х)Относительное стандартноеотклонение, (RSD)Содержание суммы полисахаридов в травекульбабы осенней (%)Образец №1Образец №2Образец №39,549,409,969,869,5310,169,669,319,719,599,0210,429,578,8610,249,899,1510,159,699,2110,11±0,39±0,64±0,634,036,956,23Разработанной методикой проанализирована трава кульбабы осенней и кульбабышершавоволосистой, заготовленные в различных местах произрастания, в течение 2013-2014годов.
Результаты количественного определения суммы полисахаридов в траве кульбабыосенней и в траве кульбабы шершавоволоситой приведены в таблице 32.115Таблица 32 – Содержание суммы полисахаридов в траве кульбабы осенней и кульбабышершавоволоситой (n = 5, P = 95%)Метрологическая характеристика методикиХ, %S2SΔХEотн,%Кульбаба осенняяМесто сбора сырьяКурская обл.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
