Диссертация (1141351), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Тогда для определения истинного «cut-off», соответствующегореальной выборки лиц, попадающих на освидетельствование, функцию f(x|1)(зеленая кривая) следует умножить на величину p1/p2 = (1 – p)/p = 42 .Эта функция показана на рисунке 26 кривой черного цвета. Таким образом,величина «cut-off» для граничной концентрации разделения между классами 1 и 2попадает в интервал, отмеченный на рисунке 26 черными треугольниками. Нижняяграница концентрации равна 101.9 (80 нг/мл), а верхняя составляет 102.05, т.е.
11083нг/мл. Любое значение из этого диапазона может соответствовать «cut-off»исследуемых реагентов для ИХА при реальной выборке (т.е. c учетом преваленса)и отмеченного выше априорного требования на минимизации ошибки на всёминтервале измерений. Это позволяет использовать данный уровень «cut-off» (80–110 нг/мл) в практических целях для минимизации затрат при проведении ХТИ, впротивном случае, многочисленные пробы с ложноположительными результатамианализа на предварительной стадии ХТИ будут направлены на трудоемкуюподтверждающую стадию исследования, стоимость которой относительна высока.Такой оптимальный уровень порогового значения позволит минимизироватьколичество ложноположительных результатов и практически исключив появлениеложноотрицательных результатов.
Следует отметить, что найденные значения«cut-off» существенно превышают значение «cut-off», найденное по методикеROC-анализа, явно неучитывающей преваленс в реальной выборке [21]. Еще разотметим, что вероятность p (один на 43) соответствует обнаружению катиноновсреди лиц, попадающих на освидетельствование – не среди всех людей!3.2 Идентификация синтетических производных катинона и (или) ихметаболитов методом ГХ-МСВ качестве подтверждающего метода при определении синтетическихкатинонов в образцах мочи использовался метод ГХ-МС.При рекомендуемом нами уровне порогового значения 100 нг/мл дляобнаружениясинтетическихкатинонов(иихметаболитов)настадиипредварительного метода исследования, следующим шагом было проверитьэкспериментально возможность качественной идентификации исследуемыхсоединений в моче с концентрацией на уровне рассчитанного «cut-off».Нами была оценена возможность проведения оптимизированной методикипробоподготовки мочи для извлечения веществ, обладающих основнымисвойствами, и последующего газохроматографического анализа, общая схемакоторойуниверсальнаиширокоприменяетсявпрактикехимико-токсикологических лабораторий и лабораториях судебно-медицинской экспертизы(п.
2.2.2).84В литературных данных широко применяется анализ новых ПАВ методомГХ-МС в режиме регистрации масс-спектрометра по выбранным ионам (SIM).Учитывая этот факт, для идентификации образцов мочи с относительно низкойконцентрацией аналитов в режиме регистрации масс-спектров SIM были выбраныионы: 84 m/z, 121 m/z, 126 m/z, 149 m/z для MDPV и 77 m/z, 84 m/z, 105 m/z, 126m/z, 188 m/z для α-PVP (рис.27).Детектирование производили путем сравнения полученного масс-спектрапика с библиотечным масс-спектром.
При анализе использовали программуавтоматизированной системы масс-спектральной деконволюции и идентификации(AMDIS) и библиотеки масс-спектров NIST 14 и SWGDRUG (версия 3.2, октябрь2017).Хроматограммы мочи и масс-спектры пиков аналитов, содержащей 100 нг/млMDPV и 100 нг/мл α-PVP, представлены на рисунках 28–31. Полученные массспектры соответствовали масс-спектрам из целевых библиотек NIST 14 иSWGDRUG.α-PVPMDPVРисунок 27 – Фрагментация α-PVP и MDPVИон с m/z 77 соответствует бензольному фрагменту в молекуле α-PVP, а ионс m/z 121 соответствует 3,4-метилендиоксибензольному фрагменту молекулыMDPV. Фрагментация молекулы с получением иона с m/z 126 – отщепление Nбутилпирролидинового фрагмента.85Для метаболитов с 2-оксо-структурой α-PVP и MDPV характернообразование иона с m/z 98 с интенсивностью более 50% (N-метил-2-оксопирролидиновый фрагмент). Ион с m/z 126 в масс-спектре α-PVP, и ион с m/z 140вмасс-спектре2-oксо-метаболитаимеютнаибольшиеинтенсивности.Интенсивности других характеристических ионов в спектре α-PVP не превышают10%.Спектрометрия с выбранным ионом с m/z 126 позволяет контролироватьприсутствие соединений с неизмененным пирролидиновым кольцом, а с ионом сm/z 140 – соединений с 2-оксо-структурой.Рисунок 28 – Хроматограмма мочи в режиме сканирования по выбранным ионам (SIM),концентрация MDPV 100 нг/мл.
Время выхода MDPV – 12,66 мин.%10084149751211265025090100110120130140150Рисунок 29 – Масс-спектр MDPV в режиме сканирования по выбранным ионам (SIM)86Рисунок 30 –Хроматограмма мочи в режиме сканирования по выбранным ионам (SIM),концентрация α-PVP 100 нг/мл. Время выхода α-PVP – 10,71 мин.%126100755025847710508090100188110120130140150160170180190Рисунок 31 – Масс-спектр α-PVP в режиме сканирования по выбранным ионам (SIM)Отношение сигнала в максимуме пика в момент времени выхода вещества котношению уровня шума в тот же момент время при сравнении с контрольнойпробой (blank) называется отношением сигнал/шум (S/N).Для методик с инструментальной оценкой результата анализа методами, длякоторых наблюдается шум базовой линии, в нормативной документацииустанавливают минимальное количество определяемого вещества в образце, прикотором величина отношения аналитического сигнала к уровню шумов равна 3 [7].В момент времени выхода MDPV (12,66 мин) отношение сигнал/шум состаляетболее 10 (S/N=12), а в момент времени выхода α-PVP (10,71 мин) данный параметрсвыше 20 (S/N=23).
При этом учитывая значения S/N для каждого соединения,можно теоретически говорить об пределе обнаружения около 30 нг/мл. Такимобразом, в результате пробоподготовки мочи по данной схеме, мы смогли87идентифицировать исследуемые аналиты в концентрации, соответствующейпредложенному уровню порогового значения (100 нг/мл).Заключительнымшагомэкспериментабыланализ образцовмочи,содержащих анализируемые вещества.Синтетические катиноны и (или) их метаболиты зачастую присутствуют вмоче в диапазоне относительно высоких концентраций (как правило свыше 300нг/мл, согласно полученным данным), поэтому при анализе на ГХ-МСсинтетических катинонов и их производных, выделенные концентрации аналитовво время процедуры пробоподготовки достаточны для анализа в режиме пополному ионному току (SCAN), что позволяет надежно идентифицироватьхроматографируемые вещества.Набор основных метаболитов α-PVP и MDPV наглядно иллюстрируютхроматограммы образцов мочи потребителей данных НС.
Пробоподготовкаобразцов мочи осуществлялась по методике, описанной ранее в п. 2.2.2.Нарисунке32представленахроматограммамочи,вкоторойидентифицированы α-PVP (время удерживания 10.71 мин) и метаболиты – 2-oксоα-PVP (время удерживания 11.82 мин), OH-α-PVP (время удерживания 10.98 мин).Масс-спектры данных соединений приводятся на рисунках 33– 35.
В отобранныхна исследование образцах мочи MDPV и его метаболитов обнаружено не было.Рисунок 32– Пример хроматограммы мочи, содержащей следующие соединения: 1 – αPVP, 2 – OH-α-PVP (метаболит α-PVP), 3 – 2-оксo-α-PVP (метаболит α-PVP)88Рисунок 33 – Масс-спектр α-PVP в режиме SCANРисунок 34 – Масс-спектр OH-α-PVP в режиме SCANРисунок 35 – Масс-спектр 2-oксо-α-PVP в режиме SCAN3.2.1 Влияние гидролиза и дериватизации на сохранность исследуемыханалитовАнализируемые соединения, в случае необходимости, подвергаютсяпредварительной химической модификации (дериватизации) для улучшениялетучести, улучшения термической стабильности и для повышения пределадетектирования.
Гидролиз в кислых условиях может также применяться дляидентификации дополнительных (минорных) метаболитов.Учитывая факт, что в процессе метаболизма α-PVP и MDPV образуются89гидроксилированные метаболиты, которые могут образовывать конъюгаты, намибыло принято решение оценить влияние проведения гидролиза в кислых условияхи дериватизации в процессе пробоподготовки на сохранность целевых аналитов (ихосновных метаболитов).
Также была изучена возможность получения дериватов.Для проведения гидролиза в кислых условиях в пробирку с завинчивающейсякрышкой объемом 10 мл добавили 3 мл анализируемой мочи, затем 10 мкл растворавнутреннего стандарта (дифениламин с концентрацией 1 мг/мл) с помощьюмикрошприца для хроматографии, 300 мкл концентрированной соляной кислоты,закрыли крышкой, поместили в сухожаровой шкаф и выдерживали 30 минут притемпературе 95°С. Гидролизат охладили до комнатной температуры, после чегонейтрализовали добавлением 300–350 мкл 40% раствора гидроксида натрия.Контроль pH осуществляли с помощью универсальной индикаторной бумаге.Далее проводили пробоподготовку по ранее описанной методике (п.
2.2.2),но после стадии упаривания проводили дериватизацию с помощью MBTFA сцелью получения трифторацетильных производных. Сухой остаток послеупаривания растворили в 20 мкл MBTFA, поместили в сухожаровой шкаф ивыдерживали 20 минут при температуре 80°C в герметично закрытом флаконе.После упаривали досуха в токе сухого воздуха при нагревании 50°С. Затем сухойостаток перерастворяли в 100 мкл этилацетата и переносили во вставку для виалы,позволяющей использовать автоматический инжектор для ввода пробы в газовыйхроматограф, закрывали виалу крышкой и анализировали методом ГХ-МС приусловиях, указанных в п.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
