Диссертация (1141348), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Разработка методики количественного определения аналитов вплазме крови3.3.1. Отбор проб, пробоподготовка.Венозную кровь отбирали в вакумные пробирки с ЭДТА, отделяли плазму спомощью центрифугирования 10 мин при 2000 об/мин и отбирали 1-2 мл плазмыв полипропиленовые пробирки типа эппендорф. Сыворотку замораживали ихранили в холодильнике при – 20°С. С учетом циркадности секреции эндогенныхвеществ, забор крови проводили не позднее 8:00 часов.Пробоподготовка плазмы кровиДля выполнения задачи разработки методики совместного определения всеханалитов в одной пробе, необходимо разработать соответствующий методпробоподготовки, позволяющий произвести их изолирование при совместномприсутствии.
В качестве метода пробоподготовки был выбран метод твердофазнойэкстракции,позволяющийпоследующимупариваниемпроизвестиэлюатаэкстрагированиеивсехконцентрированияаналитовпробыспутемперерастворения сухого остатка в меньшем объеме жидкости.Была проведена работа по определению состава элюента, а также растворовдля промывки и активации картриджа, позволяющего в максимально полномобъемеэкстрагироватьприведена ниже:определяемыевещества.Разработаннаяметодика56Картридж Chromabond® С18 для ТФЭ активировали последовательно 1 млметанола, 1 мл ацетона, 1 мл воды и 2 мл боратного буфера (рН=9,6).
К 500 мклплазмыдобавляливнутреннийстандарти20мклконцентрированнойортофосфорной кислоты. Осторожно перемешивали, выдерживали 5 мин ивводили в картридж самотеком. Затем последовательно добавляли 1 мл воды, 1 мл0,1 М раствора гидроксида натрия, 1 мл смеси ацетонитрил:вода (10:90) ивысушивали под вакуумом в течение 2 мин.
Элюировали 1 мл 0,1% растворомтриэтиламина в метаноле в стеклянные флаконы и упаривали досуха притемпературе 70 °С. Сухой остаток растворяли в 100 мкл 50% водного метанола и20 мкл вводили в хроматограф.3.3.2.Подбор хроматографических условийВ качестве метода определения был выбран метод высокоэффективнойжидкостной хроматографии с обращенной фазой. В качестве детектора былвыбрантандемныймасс-спектрометр,которыйявляетсянаиболеечувствительным и специфичным, что позволяет совместное определениебольшого количества веществ.Исследуемые вещества имеют различные химические свойства; по большейчасти молекулы неполярны, при этом ряд из них обладает кислотнымисвойствами, а ряд - основными.
Хроматографическое разделение проводилось наколонке Agilent Eclipse XDB-C18, 2,1*50 мм, 1,8 мкм. Для лучшего разделениявеществ был разработан метод градиентного элюирования, что позволилоразделить аналиты надледащим образом. Для этого экспериментально былипроверены разные составы подвижных фаз (ацетонитрил: 0,1% раствормуравьиной кислоты в воде, метанол : фосфатный буфер (pH=5,4), 0,1% раствормуравьиной кислоты в ацетонитриле: 0,1% раствор муравьиной кислоты в воде).В Таблице 4 приведены хроматографические условия разработаннойметодики.57Таблица 4– Хроматографические параметры и параметры детектораТаблица 4.1.
Параметры оборудованияХроматограф:Agilent 1290 InfinityКолонка:Agilent Eclipse XDB-C18, 2,1*50 мм, 1,8 мкмТемпература термостата50 ºСМобильная фаза:Растворитель А: 5 мМ аммония формиата в 0,01% растворемуравьиной кислоты в водеРастворитель B: 0,01 % муравьиной кислоты в ацетонитриле.Скорость потока:0,4 миллилитра в минутуОбъем ввода аналита:10 мклВремя14 минхроматографирования:Параметры масс-Тип ионизации: Электроспрей (ESI)спектрометра:Напряжение на капилляре: 3500 ВТемпература ионной трубки: 350 °СТемпература ионизационной камеры: 400 °СВспомогательный газ: 10,00 литров в минутуГаз периферийного слоя: 11,00 литров в минутуГаз соударения: 3,00 литров в минутуДавление газа в коллизионной ячейке: 2,0 мТоррТаблица 4.1 – Режим градиентного элюированияВремя, Растворитель растворительминА, % (об/об)В, % (об/об)090,010,01,590,010,02,080,040,08,530,070,012,095,05,014,090,010,058Таблица 4.2 – Параметры MRM-переходов:ПараметрКофеинПараксантинЛозартанE3174Кортизол6-βгидроксикортизолПинолинПараксантин+6гидрокси1,2,3,4тетрагидро-βкарболин+ПолярностьИонпрекурсор (m/z)Дочернийион (m/z)Энергиясоударения, В++++--195,0181,0423,2437,2407,0423,0203,2189,0237,1138,3123,4207,1303034235,134331,0347,0147,0117,0194,0-26-26353030+Приблизительные времена удерживания исследуемых веществ, мин: кофеин –около 4,1; параксантин – около 3,0; лозартан - около 7,0; E-3174 – около 6,2;кортизол – около 4,9; 6-β-гидроксикортизол – около 4,3; 6-гидрокси-1,2,3,4тетрагидро-β-карболин – около 1,1; пинолин – около 5,0; карбамазепин – около7,2.593.4.
Валидация разработанных методик количественного определенияаналитов в плазме крови и мочеВалидация разработанных методик проводилась в соответствии соследующими нормативными документами:1.Руководство по экспертизе лекарственных средств / Под. ред. проф.А.Н. Миронова. Том I. – М.: Гриф и К, 2013. 328 с.2.Guidance for Industry: Bioanalytical method validation (draft guidance).U.S.
Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Centerfor Drug Evolution and Research (CDER). U.S. Government Printing Office:Washington, DC, 2013.3.Guideline on bioanalytical method validation. European MedicinesAgency. Committee for medicinal products for human use: London, 2011.4.Методические указания «Оценка биоэквивалентности лекарственныхсредств». Под ред.
В.Г. Кукеса, В.П. Фисенко. М., МЗиСР России, 2008.В результате валидации была доказана пригодность методик дляиспользования в лабораторной практике. Ниже приведено описание валидации поосновным параметрам.3.4.1.ДляСелективностьопределенияпараметровселективностиотбирали6образцовбиологической матрицы (плазма крови или моча), очищенных от мешающихэндогенных веществ, к которым добавляли стандартные растворы определяемыханалитов.60Для приготовления бланковой мочи биообъект подвергали двухкратнойжидкостной экстракции смесью этилацетат : гексан : диэтиловый эфир (50:35:15)с последующим добавлением к отделенной водной фазе боратного буфера (pH =9,4) и смеси этилацетат : гексан (50:50).Бланковую плазму крови, очищенную от эндогенных веществ, готовилипутем жидкостной экстракции.
К образцу плазмы крови добавляли 0,1 М растворгидроксида натрия и смесь диэтиловый эфир : этилацетата (3:1). Проводилиэкстракцию, органический слой отбрасывали, оставляя водный слой в качествебланка.На хроматограммах образцов интактной биожидкости отсутствовали пики,характеристические для определяемых веществ. Хроматограммы, полученныепри определении селективности методик, приведены на Рисунках 4 – 13 (моча) и14 – 23 (плазма крови). Концентрация аналитов в образцах соответствуетнижнему пределу количественного определения (нПКО) разработанных методик.Рисунок 4 – Хроматограмма образца мочи без содержания определеяемых веществ(кофеин/параксантин)61Рисунок 5 – Хроматограмма образца мочи без содержания определеяемых веществ (лозартан/E3174)Рисунок 6 – Хроматограмма образца мочи без содержания определеяемых веществ (кортизол/6β-гидроксикортизол)Рисунок 7 – Хроматограмма образца мочи без содержания определеяемых веществ(пинолин/метаболит)62Рисунок 8 – Хроматограмма образца мочи без содержания определеяемых веществ (ВСкарбамазепин)Рисунок 9 – Хроматограмма образца мочи, содержащей определяемые вещества(кофеин/параксантин) на уровне нПКО (10 нг/мл; 10 нг/мл)Рисунок 10 – Хроматограмма образца мочи, содержащей определяемые вещества (лозартан/E3174) на уровне нПКО (10 нг/мл; 10 нг/мл)63Рисунок 11 – Хроматограмма образца мочи, содержащей определяемые вещества (кортизол/6β-гидроксикортизол) на уровне нПКО (10 нг/мл; 10 нг/мл)Рисунок 12 – Хроматограмма образца мочи, содержащей определяемые вещества(пинолин/метаболит) на уровне нПКО (0,5 нг/мл; 0,5 нг/мл)Рисунок 13 – Хроматограмма образца мочи, содержащей определяемые вещества (ВСкарбамазепин)64Рисунок 14 – Хроматограмма образца плазмы крови без содержания определеяемых веществ(кофеин/параксантин)Рисунок 15 – Хроматограмма образца плазмы крови без содержания определеяемых веществ(лозартан/E3174)Рисунок 16 – Хроматограмма образца плазмы крови без содержания определеяемых веществ(кортизол/6-β-гидроксикортизол)65Рисунок 17 – Хроматограмма образца плазмы крови без содержания определеяемых веществ(пинолин/метаболит)Рисунок 18 – Хроматограмма образца плазмы крови без содержания определеяемых веществ(ВС карбамазепин)Рисунок 19 – Хроматограмма образца плазмы крови, содержащей определяемые вещества(кофеин/параксантин) на уровне нПКО (50 нг/мл; 50 нг/мл)66Рисунок 20 – Хроматограмма образца плазмы крови, содержащей определяемые вещества(лозартан/E-3174) на уровне нПКО (50 нг/мл; 50 нг/мл)Рисунок 21 – Хроматограмма образца плазмы крови, содержащей определяемые вещества(кортизол/6-β-гидроксикортизол) на уровне нПКО (50 нг/мл; 50 нг/мл)Рисунок 22 – Хроматограмма образца плазмы крови, содержащей определяемые вещества(пинолин/метаболит) на уровне нПКО (0,25 нг/мл; 0,25 нг/мл)67Рисунок 23 – Хроматограмма образца плазмы крови, содержащей определяемые вещества(ВС карбамазепин)Критерием приемлемости отсутствия потенциально мешающих веществявляется то, что значения площади хроматографических пиков со временамиудерживания, характерными для аналитов, не превышают 20% от значенияплощади пика стандарта нПКО определяемых веществ.683.4.2.ДляЛинейностьопределениялинейностиготовили8образцовинтактнойбиологической матрицы с добавлением рабочих растворов исследуемых аналитов,как указано в Таблице 5а (моча) и Таблице 5б (плазма крови), и проводилихроматографический анализ.
Затем по результатам анализа были построеныкалибровочные кривые (приведены на Рисунке 14а (моча) и Рисунке 15а (плазмакрови)), где также приведены соответствующие уравнения калибровочныхкривых.Порезультатамполученныхкалибровочныхкривыхрасчитаныконцентрации используемых калибровочных стандартов по калибровочнымкривым. По полученным данным проведена статистическая обработка. Врезультате статистических расчётов была доказана линейность разработаннойметодики, соответствующая критерию приемлимости – расчётное значениеконцентрации аналитов на уровне нПКО отклоняется от значения теоретическойконцентрации не более, чем на 20%; отклонение значений концентрацийостальных калибровочных уровней составило не более 15% от значениясоответствующейтеоретическойконцентрации.69Таблица 5а – Содержание определяемых веществ в калибровочных образцах (моча)№ пробыКофеинПараксантинЛозартанE-3174Кортизол6-β-гидроксикортизолПинолин6-гидрокси-1,2,3,4тетрагидро-βкарболинКарбамазепин (ВС)11010101010100,500,5022525252525250,750,751010Концентрация аналита, нг/мл345675010025050010005010025050010005010025050010005010025050010005010025050010005010025050010001,00 1,502,002,505,001,00 1,502,002,505,00101010101082500250025002500250025007,507,50950005000500050005000500010,0010,00101070Таблица 5б – Содержание определяемых веществ в калибровочных образцах (плазма)№ пробыКофеинПараксантинЛозартанE-3174Кортизол6-β-гидроксикортизолПинолин6-гидрокси-1,2,3,4тетрагидро-βкарболинКарбамазепин (ВС)15050505050500,250,2521501501501501501500,750,751010Концентрация аналита, нг/мл34567300500 100025005000300500 100025005000300500 100025005000300500 100025005000300500 100025005000300500 1000250050001,00 1,251,051,752,001,00 1,251,051,752,00101010101087500750075007500750075002,252,2591000010000100001000010000100003,003,00101071Параксантин (моча)108y = 0,0019x - 0,0061R² = 0,9961264200100020003000400050006000Концентрация кофеина, нг/млОтношение площадипика параксантина кплощади пика ВСОтношение площадипика кофеина кплощади пика ВСКофеин (моча)108y = 0,0017x + 0,0004R² = 0,999646420010,510002000300040005000Концентрация лозартана, нг/мл6000Отношение площадипика E-3174 к площадипика ВСОтношение площадипика лозартана кплощади пика ВСy = 0,0004x + 0,0418R² = 0,9959603000400050006000E-3174 (моча)202000Концентрация параксантина, нг/млЛозартан (моча)1,5100076543210y = 0,0012x + 0,1023R² = 0,99712010002000300040005000Концентрация E-3174, нг/мл6000726-β-OH-кортизол (моча)0,25y = 4E-05x + 0,009R² = 0,996370,20,150,10,0500100020003000400050006000Концентрация кортизола, нг/млОтношение площадипика 6-β-OH-кортизолак площади пика ВСОтношение площадипика кортизола кплощади пика ВСКортизол (моча)0,00350,0030,00250,0020,00150,0010,000500,004y = 0,0003x + 3E-05R² = 0,998150,0030,0020,001002468024681012Концентрация 6-β-OH-кортизола, нг/млМетаболит пинолина (моча)10Концентрация пинолина, нг/мл12Отношение площадипика метаболИтапинолина к площадипика ВСОтношение площадипика лозартана кплощади пика ВСПинолин (моча)y = 0,0003x + 3E-05R² = 0,998150,0040,003y = 0,0003x + 3E-05R² = 0,99280,0020,0010024681012Концентрация метаболита, нг/млРисунок 14а – Калибровочные кривые, построенные после анализа калибровочных образцов (моча)732y = 0,0002x - 0,0103R² = 0,996281,510,50-0,50200040006000800010000 12000Концентрация кофеина, нг/млПараксантин (плазма крови)Отношение площадипика параксантина кплощади пика ВСОтношение площадипика кофеина кплощади пика ВСКофеин (плазма крови)1,210,80,60,40,2010,500200040006000800010000 12000Концентрация параксантина, нг/мл20004000600080001000012000E-3174 (плазма крови)Отношение площадипика E-3174 кплощади пика ВСОтношение площадипика лозартана кплощади пика ВСy = 0,0001x + 0,0089R² = 0,996320Концентрация параксантина, нг/млЛозартан (плазма крови)1,5y = 0,0001x + 0,0124R² = 0,997143,532,521,510,50y = 0,0003x + 0,0375R² = 0,997820200040006000800010000Концентрация параксантина, нг/мл12000746-β-OH-кортизол (плазма крови)3y = 0,0003x - 0,0062R² = 0,996972,521,510,50020004000600080001000012000Концентрация кортизола, нг/млОтношение площади пика6-β-OH-кортизола кплощади пика ВСОтношение площади пикакортизола к площадипика ВСКортизол (плазма крови)353025201510500,0070,0060,0050,0040,0030,0020,0010020004000600080001000012000Концентрация 6-β-OH-кортизола, нг/млМетаболит пинолина (плазма крови)0,01y = 0,002x + 7E-05R² = 0,997030123Концентрация пинолина, нг/мл4Отношение площадипика метаболИтапинолина к площадипика ВСОтношение площадипика пинолина кплощади пика ВСПинолин (плазма крови)y = 0,003x + 0,3265R² = 0,9976y = 0,0025x + 0,0002R² = 0,996630,0080,0060,0040,002001234Концентрация метаболита, нг/млРисунок 14б – Калибровочные кривые, построенные после анализа калибровочных образцов (плазма крови)753.4.3.Эффект матрицы и степень извлеченияДля оценки влияния сопутствующих веществ, находящихся в матрице, наколичественное определение исследуемых аналитов, проводят расчёт фактораматрицы,которыйпредставляетхроматографическогопикааналитасобойвзначенияобразцесотношенияматрицойкплощадиплощадихроматографического пика аналита той же концентрации в чистом растворе (безматрицы).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
