Диссертация (1141348), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Дебризохин и его метаболит – 4-гидроксибрихохин – определяется вмоче. В качестве метода количественного определения используется методВЭЖХ-МС, пробоподготовка – жидкостная экстракция и ТФЭ. Недостаткомметодик с использованием дебризохина является тот факт, что в метаболизмеданного вещества помимо CYP2D6 учавствует изофермент CYP1A1 [43, 44].Также существуют методики с использованием бета-адреноблокаторов, вчастности, с использованием метопролола.Метопрололможетприменятьсякаксубстрат-маркертолькоприиспользовании плазмы крови в качестве биообъекта, т.к. при определении в мочеотношения метопролола к его метаболиту, α-гидроксиметопрололу, наблюдаетсявлияние значения рН мочи на «метаболическое отношение».
Таким образом,фенотипирование с применением метопролола затруднительно. К тому же, около20% метаболизма метопролола опосредуются другими изоферментами (CYP1A2,CYP1A11) [43,45].В литературе можно встретить множество методик, использующих вкачествесубстратаCYP2D6декстрометорфан.Вкачествебиожидкостииспользуются как плазма, так и моча; в некоторых методиках используетсяслюна.Основныминедостаткамиданныхметодикявляетсявозможнаяиндивидуальная непереносимость субстрата. К тому же, зачастую в методикахиспользуются дозы декстрометорфана, близкие к терапевтическим. Являясьсильнодействующим веществом, декстрометорфан может вызывать различныенежелательные лекарственные явления.
Более того, около 15% веществаметаболизируется другими ферментами (CYP3A4, CYP3A5, CYP2C19) [46,47].На сегодняшний день усиленно ведется поиск эндогенных субстратов,трасформирующихся исключительно CYP2D6. В одном из таких исследований25было установлено, что СYP2D6 обладает исключительной тропностью к такимэндогенным веществам, как 5-MDMT и пинолин.
Для контроля проводилосьдобавление к исследуемым субстратам специфических моноклональных антител,в результате чего активность СYP2D6 падала, и О-деметилирование 5-MDMT ипинолина не наблюдалось. Определено, что пинолин на 99% метаболизируетсялишь изоферментов CYP2D6. Вполне возможно, что использование именнопинолина в качестве эндогенного субстрата-маркера CYP 2D6 позволитразработать точную и селективную методику определения активности данногоизофермента [48,49,80].CYP3A4Самым быстрым из достоверных методов определения активностиизофермента CYP3A4 считается эритромицин дыхательный тест.Данный тест использует дозу радиоактивно меченного эритромицина каксубстрата для фермента CYP3A4.
Субстрат вводят внутривенно. В печениизофермент метаболизирует эритромицин, превращая меченную метильнуюгруппувформальдегид(реакцияN-деметилирования),которыйзатемметаболизируется в диоксид углерода. Меченный диоксид углерода выводитсяорганизмом через легкие, поэтому его можно определить спустя 20-30 минутпосле инъекции тестовой дозы эритромицина. Количество изотопа С-14, спомощью которого наносят радиоактивную метку, в выдыхаемом воздухекоррелирует с количеством эритромицина, подвергшегося метаболизму заединицу времени [50,51].Несмотря на быстроту данного метода, он обладает рядом недостатков,важнейшим из которых является использование радиоактивно меченных молекул,что само по себе является сравнительно вредным для организма; к тому же,меченные препараты повышают стоимость методики [91].На сегодняшний день широко распространены методики определенияактивности CYP3A4 с использованием эндогенных субстратов.
Одним из нихявляется кортизол, метаболизирующийся в 6-β-гидроксикортизол [82]. В качествеметода количественного определения используется метод ВЭЖХ-МС или ВЭЖХ-26МС/МС [52,53,67,68]. Так же часто встречаются методики определенияактивности CYP 3A4 с использованием в качестве маркёра холестерола и егометаболита 4β-гидроксихолестерола. В частности, данная методика применяетсядля определения активности CYP 3A4 у онкологических больных длякорректировки доз назначаемых препаратов [70,71].Основные недостатки данных методик заключаются в риске возникновениянежелательных лекарственных явлений при приеме субстратов, что создаетсущественныетрудностидлявнедренияданныхметодоввширокуюлабораторную и клиническую практику.
Внутривенное введение субстратов, атакже использование плазмы крови в качестве биообъекта, делают методикипригодными только для использования в стационарах. К тому же, данные тестыне применимы для беременных женщин ввиду тератогенности некоторыхсубстратов.1.5.«Коктейльные» методы фенотипирования изоферментовCYP«Коктейльный»методфенотипированиязаключаетсявсовместномопределении активности нескольких изоферментов цитохрома P450 путёмсовместного количественного определения нескольких соответствующих парсубстрат/метаболит в биообъекте. Для решения подобной задачи необходимоиспользовать точный, селективный и воспроизводимый метод инструментальногоанализа веществ в биообъектах, коим является метод высокоэффективнойжидкостной хроматографии с различными видами детектирования. Одной изважнейших задач является разработка методики пробоподготовки, позволяющей27провести извлечение всех определяемых веществ в одну пробу.
Помимо этого,необходимо подобрать соответствующие хроматографические условия и условиядетектирования,которыепозволятпровестисовместноеколичественноеопределение аналитов.Bing Zhu и соавторы одними из первых опубликовали работу, в которойописан «коктейльный» метод фенотипирования [54]. Целью данной работыявлялась разработка и валидация «коктейльного» метода для определенияактивности изоферментов CYP3A, CYP1A2, CYP2C19, CYP2E1 и CYP2D6.В исследовании принимали участие 14 здоровых добровольцев, принявшихперорально «коктейль», состоящий из 100 мг кофеина (CYP1A2, метаболит –параксантин),200мггидроксихлороксазон),хлорзоксазона100мг(CYP2Е1,мефенитоинаметаболит(CYP2C19,–метаболит6–4’гидроксимефенитоин), 100 мг метопролола (CYP2D6, метаболит – aгидроксиметопролол)и7,5мгмидазолама(CYP3A,метаболит–1’-гидроксимидазолам). Используемые биообъекты – плазма крови и моча. Плазмакрови использовась для определения активности изоферментов CYP2E1, CYP3Aи CYP1A2, моча – для изоферментов CYP2C19 и CYP2D6.
Количественноеопределениепроводилосьметодомобратнофазнойвысокоэффективнойжидкостной хроматографией с использованием УФ-детектора.Пробоподготовка образцов заключалась в отдельном извлечении каждойпары субстрат/метаболит из биообъекта. Извлечение кофеина и параксантинапроводилось с помощью жидкость-жидкостной экстракции смесью хлороформизопропанол (9:1). Экстракция 4’гидроксимефенитоина из мочи проводиласьдиэтиловым эфиром после ферментной деконъюгации (внутренний стандарт –фенобарбитал). Хлорзоксазон и его метаболит изолировались путем экстракциидиэтиловым эфиром с предшествующей деконъюгацией глюкуронидазой сдобавлениемфенацетинавкачествевнутреннегостандарта. Экстракцияметопролола и a-гидроксиметопролола из мочи проводилась с помощьюдихлорметана после подщелачивания биообъекта до pH=5,5 (внутренний стандарт– пропранолол).
Извлечение мидазолама и гидроксимидазолама из плазмы28проводилось путем добавления к образцу аминоуксусного буфера с последующейэкстракцией диэтиловым эфиром. Количественное определение проводилосьметодом ВЭЖХ с УФ- и флуорометрическим детектированием, при этомхроматографическое разделение проводилось с использованием разных типовколонок и подвижными фазами разного состава.Недостатком данной методики является невозможность ее использования вповседневной практике ввиду многоэтапной затрудненной пробоподготовкой ираздельным количественным определением изучаемых веществ. Кроме этого,используемый в качестве субстрата хлороксазон способен в указанной дозировкевызвать нежелательные лекарственные явления.Со временем идея «коктейльного» метода фенотипирования набиралапопулярностьвкачествеметодаопределенияактивностиизоферментовцитохрома P450 in vivo.
В 2003 году M.Christensen и соавторы описали «коктейль»Karolinska, в состав которого входили кофеин 100 мг (CYP1A2, метаболит параксантин), лозартан 25 мг (CYP2C9, метаболит – Е-3174), омепразол 20 мг(CYP2C19, метаболит – 5-гидроксиомепразол), дебризохин 10 мг (CYP2D6,метаболит – 4-гидроксидебризохин) и хинин 250 мг (CYP3A4, метаболит – 3гидроксихинин) [55]. Лозартан, дебризохин и их метаболиты определялись вмоче, а кофеин, омепразол, хинин и их метаболиты – в плазме крови.
В качествепробоподготовки используется многоэтапная жидкостная экстракция, извлечениекаждой пары субстрат/метаболит проводилось по отдельности. В качествеинструментального метода использовался метод ВЭЖХ-УФ.В том же году S.Chainuvati и соавторы описали «коктейль» Cooperstown5+1, позволяющий определить активность изоферментов CYP1A2, CYP2C19,CYP3A4, CYP2D6, и CYP2C9 с помощью перорального введения кофеина,омепразола, мидазолама декстрометорфана, и S-варфарина соответственно [56]. В2004 году Yin и соавторы предложили использовать «коктейль» из 40 мгомепразола (CYP2C19), 2 мг/кг кофеина (CYP1A2), 30 мг декстрометорфана(CYP2D6), 0,025 мг/кг мидазолама (CYP3A) и 10 мг варфарина (CYP2C9) с целью29определения активности соответствующих изоферментов in vivo [57]. Все ЛВ, заисключением мидазолама, вводились перорально; мидазолам - внутривенно Вкачестве биообъекта использовалась как плазма, так и моча.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
