Диссертация (1141348), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Оборудование•высокоэффективный жидкостной хроматограф Agilent 1260 включающий всебя градиентный насос, дегазатор, автосамплер, фотодиодноматирчынй детектори тандемный масс-спектрометрический детектор Agilent 6460, США;•колонка Agilent Eclipse XDB-C18, 2,1*50 мм, 1,8 мкм•центрифуга AllegraX-30R, c охлаждением, Beckman Coulter, Германия;•вортекс ElmiV-3, Elmi, Латвия;•морозильник низкотемпературный для хранения замороженной плазмыMDF-U74V, Sanyo, Корея;•весы Ohaus РА214С, Ohaus, США;•дозатор переменного объема одноканальный «Колор» 10-5000 мкл, ThermoScientific, Россия;•дозаторы пипеточные одноканальные переменного объема «Техно» 100-1000, Thermo Scientific, Россия;•холодильник фармацевтический, Liebherr, ЕС;•морозильник микропроцессорный для хранения замороженной плазмыкрови и других биологических материалов ММ-180 «Позис», Позис, Россия.462.3.
РеактивыСтандарты определяемых веществ•кофеин (Merck, C1778-1VL);•параксантин (Santa Cruz Biotechnology, sc-212526);•лозартан (Merck, 61188-100MG);•E-3174 (Clearsynth, CS-O-10324);•кортизол (Merck, H4001-1G);•6-β-гидроксикортизол (Merck, H6904-1MG);•пинолин (Merck, 37858-100MG);•6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидро-β-карболин (Aurora Fine Chemicals кат. №А06.795.158);•карбамазепин (Merck, 94996-100MG)Реактивы•ацетонитрил (Merck, HPLC-grade);•спирт метиловый (Merck, HPLC-grade);•муравьиная кислота (Merck, HPLC-grade);•аммония формиат (Merck, extrapure);•этилацетат (х.ч.);•диэтиловый эфир (х.ч.);•изопропиловый спирт (х.ч.);•деионизированная вода;•натрия тетраборат (х.ч.);•борная кислота (х.ч.).•натрия гидроксид (х.ч.)47•триэтиламин (х.ч.)•ацетон (х.ч.)482.4. Статистическая обработкаСтатистическая обработка данных производилась с помощью программногообеспечения Microsoft Excel 2016 и IBM SPSS v.
23.0.0.0.49ГЛАВА 3. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ3.1. Выбор внутреннего стандартаВ качестве внутреннего стандарта был выбран карбамазепин. Изучивописанные «коктейльные» методы, в качестве внутренних стандартов былиопробованы следующие вещества: метопролол, пропранолол, парацетамол икарбамазепин, однако указанные лекарственные вещества часто применяются вклинической практике для коррекции различных патологических состояний, чтоможет привести к наличию этих веществ в изначальных образцах мочи.
МетодикасиспользованиемкарбамазепинавкачествеВСудовлетворилавсемвалидационным критериям. К тому же, структура карбамазепина схожа соструктурами молекул пинолина и его метаболита, что позволило снизитьзначение нижнего предела количественного определения данных веществ засчетоптимизации хроматографических параметров под определение внутреннегостандарта.Рисунок 3 – Структурная формула карбамазепина503.2. Разработка методики количественного определения аналитов в моче3.2.1.Отбор проб, пробоподготовка.Процесс отбора проб разрабатывается и проводится с максимальнойвоспроизводимостьюводинаковыхусловияхдляминизацииизменениякачественного и количественного состава образца.Так как одной из задач при разработке методики являлась минимизацияинвазивности метода и дискомфорта для пациента, то в качестве биообъекта былавыбрана моча, собранная в течение 8 часов после приёма лекарственных веществ– маркеров.
В течение этого времени метаболизируется и выводится достаточнаячасть используемых в исследовании лекарственных веществ, после чеговозможно определить концентрации веществ и их метаболитов в моче.Пробоподготовка мочиДля выполнения задачи разработки методики совместного определения всеханалитов в одной пробе, необходимо разработать соответствующий методпробоподготовки, позволяющий произвести изолирование всех аналитов.
Вкачестве метода пробоподготовки был выбран метод жидкостной экстракции,позволяющий произвести экстрагирование всех аналитов в смесь органическихрастворителейспоследующимупариваниеморганическогослояиконцентрирования пробы путем перерастворения сухового остатка в меньшемобъеме жидкости.Была проведена работа по определению состава экстрагента, позволяющегов максимально полном объеме экстрагировать определяемые вещества. Врезультате был разработан метод двойной жидкостной экстракции веществ изанализируемой пробы. Для экстрагирования всех веществ, за исключениемпинолина и его метаболита, наилучшим образом подходит смесь этилацетат :51гексан : диэтиловый эфир (50:35:15). Для экстракции пинолина и его метаболитаиз мочи следует корректировать pH образца боратным буфером, после чегопровести экстракцию смесью этилацетат : гексан (50:50).В ходе работы были опробованы следующие методики пробоподготовки:Методика пробоподготовки №1: к 0,5 мл образца мочи, помещенному вмикропробирку типа эппендорф объемом 1,5 мл, прибавляли 1 мл ацетонитрила,после чего пробирку встряхивали на вихревой мешалке в течение 10 секунд.Полученную смесь центрифугировали в течение 10 минут со скоростью 13200об/мин.
Надосадочную жидкость переливали в чистую микропробирку иупаривали в вакуумно-роторном испарителе. Полученный сухой остатокперерастворяли в 100 мкл метанола, затем полученный раствор переливали ввиалу для хроматографирования и помещали в автосемплер хроматографа.Методика пробоподготовки №2: к 0,5 мл образца мочи, помещенному вмикропробирку типа эппендорф объемом 1,5 мл, прибавляли 1 мл ацетонитрила,после чего пробирку встряхивали на вихревой мешалке в течение 10 секунд.Полученную смесь центрифугировали в течение 10 минут со скоростью 13200об/мин. Надосадочную жидкость переливали в чистую микропробирку иупаривали в вакуумно-роторном испарителе.
К сухому остатку прибавляли 1 млсмеси хлороформ : изопропанол (85:15), после чего проводили экстракцию навихревой мешалке в течение 10 минут. Органический слой упаривали навакуумно-роторном испарителе. Сухой остаток перерастворяли в 100 мклметанола,затемполученныйрастворпереливаливвиалудляхроматографирования и помещали в автосемплер хроматографа.Методика пробоподготовки №3: к 1 мл образца мочи, помещенному встеклянную пробирку для экстракции объемом 4 мл, прибавляли 2 мл смесиэтилацетат : гексан (50:50), после чего пробирку помещали в вихревую мешалкуи экстрагировали в течение 10 минут.
После процедуры экстракции органическийслой отделяли и помещали в чистую пробирку для экстракции объемом 4 мл.Эктракцию проводили дважды. Объединенный органический слой упаривали ввакуумно-роторном испарителе, после чего сухой остаток перерастворяли в 10052мклметанола,затемполученныйрастворпереливаливвиалудляхроматографирования и помещали в автосемплер хроматографа.Методика пробоподготовки №4: к 1 мл образца мочи, помещенному встеклянную пробирку для экстракции объемом 4 мл, прибавляли 2 мл смесиэтилацетат : гексан : диэтиловый эфир (50:35:15), после чего пробиркупомещали в вихревую мешалку и экстрагировали в течение 10 минут.
Послепроцедуры экстракции органический слой отделяли и помещали в чистуюпробирку для экстракции объемом 4 мл. К оставшейся водной фазе добавляли 0,5мл боратного буфера (pH=9,4), 2 мл смеси этилацетат : гексан (50:50), послечего проводили процедуру экстракции на вихревой мешалке в течение 10 минут.После экстракции органический слой отделяли и объединяли с органическимслоем, полученным после первого этапа экстракции.
Объединенный органическийслой упаривали в вакуумно-роторном испарителе, после чего сухой остатокперерастворяли в 100 мкл метанола, затем полученный раствор переливали ввиалу для хроматографирования и помещали в автосемплер хроматографа.Для разработки методики пробоподготовки были использованы различныесмеси органических растворителей. Необходимо было учитывать, что основнойцелью разработки данного метода совместного определения исследуемых веществв моче является максимальная простота и точность с целью дальнейшеговведения метода в клиническую практику.
Из методов, описанных в предыдущемразделе, наибольшие показатели полноты экстракции и воспроизводимостипродемонстрировал метод №4.3.2.2.Подбор хроматографических условийВ качестве метода определения был выбран метод высокоэффективнойжидкостной хроматографии с обращенной фазой.
В качестве детектора былвыбрантандемныймасс-спектрометр,которыйявляетсянаиболеечувствительным и специфичным, что позволяет совместное определениебольшого количества веществ.53Исследуемые вещества имеют различные химические свойства; по большейчасти молекулы неполярны, при этом ряд из них обладает кислотнымисвойствами, а ряд - основными. Хроматографическое разделение проводилось наколонке Agilent Eclipse XDB-C18, 2,1*50 мм, 1,8 мкм. Для лучшего разделениявеществ был разработан метод градиентного элюирования, что позволилоразделить аналиты надледащим образом.
Для этого экспериментально былипровереныразныесоставыподвижныхфаз(ацетонитрил:0,1%раствормуравьиной кислоты в воде, метанол : фосфатный буфер (pH=5,4), 0,1% раствормуравьиной кислоты в ацетонитриле: 0,1% раствор муравьиной кислоты в воде).В Таблице 3 приведены хроматографические условия разработаннойметодики.54Таблица 3 – Хроматографические параметры и параметры детектораТаблица 3.1. Параметры оборудованияХроматограф:Agilent 1290 InfinityКолонка:Agilent Eclipse XDB-C18, 2,1*50 мм, 1,8 мкмТемпература термостата50 ºСМобильная фаза:Растворитель А: 5 мМ аммония формиата в 0,01% растворемуравьиной кислоты в водеРастворитель B: 0,01 % муравьиной кислоты в ацетонитриле.Скорость потока:0,4 миллилитра в минутуОбъем ввода аналита:10 мклВремя14 минхроматографирования:Таблица 3.1 – Режим градиентного элюированияВремя, Растворитель растворительминА, % (об/об)В, % (об/об)090,010,01,590,010,02,080,040,08,530,070,012,095,05,014,090,010,0Таблица 3.2 – Параметры MRM-переходов:ПараметрКофеинПараксантинЛозартанE3174Кортизол6-βгидроксикортизолПинолинПолярностьИонпрекурсор(m/z)Дочернийион (m/z)Энергиясоударения,В+195,0+181,0+423,2+437,2407,0423+203,26гидрокси1,2,3,4тетрагидроβ-карболин+189,0138,3123,4207,1235,1331,0347147,0117,030303434-26-26353055Приблизительные времена удерживания исследуемых веществ, мин: кофеин –около 4,1; параксантин – около 3,0; лозартан - около 7,0; E-3174 – около 6,2;кортизол – около 4,9; 6-β-гидроксикортизол – около 4,3; 6-гидрокси-1,2,3,4тетрагидро-β-карболин – около 1,1; пинолин – около 5,0; карбамазепин – около7,2.3.3.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
