Диссертация (1141348), страница 6
Текст из файла (страница 6)
В качествепробоподготовки применялся многоэтапный метод жидкостной экстракции,каждая пара субстрат/метаболит извлекались по отдельности. Используемыйметод количественного определения – ВЭЖХ-УФ.В 2008 был описана одна из самых популярных методик фенотипирования сиспользованием «коктейля» Inje, заключающегося в пероральном приеме 93 мгкофеина (CYP1A2), 30 мг декстрометорфана (CYP2D6), 30 мг лозартана(CYP2C9), 20 мг омепразола (CYP2C19) и 2 мг мидазолама (CYP3A4) [59,63]. Всевещества с метаболитами, за исключением пары декстрометорфан/декстрорфан,определялись в плазме; указанная выше пара для CYP2D6 определялась в моче.
Вкачестве методики пробоподготовки использовалась многоэтапная жидкостнаяэкстракция,приэтомпарыкофеин/параксантиниомепразол/5-гидроксиомепразол извлекались совместно. Для количественного определенияпар декстрометорфан/декстрорфан и лозартан/Е-3174 использовался метод ВЭЖХсфлуорометрическимгидроксимидазолам,детектором.кофеин/параксантинПарыивеществмидазолам/1’-омепразол/5-гидроксиомепразолколичественно определялись методом ВЭЖХ-МС/МС, причем последние двепары определялись совместно.Общими недостатками этих методов являются затрудненная многоэтапнаяпробоподготовка с раздельным извелечением аналитов как из мочи, так и изплазмы крови. Кроме того, используемые лекарственные вещества-субстратаиспользуются в достаточно высоких дозамх (в некоторых случаях близких стерапевтическими), что не гарантирует безопасность метода ввиду рискавозникновения нежелательных лекарственных явлений [85].В 2012 году Kyung-Suk Oh и соавторы разработали «коктейль» дляопределения активности изоферментов CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 иCYP3A in vivo, в состав которого входят 10 мг кофеина, 2 мг лозартана, 200 мкгомепразола, 2 мг декстрометорфана и 100 мг мидазолама, принимаемые30перорально[74].Биообъектомявляетсяплазмакровидобровольцев.Пробоподготовка проводилась в два этапа: проводилась жидкость-жидкостнаяэкстракция этилацетатом, органический слой отделяли, после чего к оставшемусяводному слою прибавляли уксусную кислоту для коррекции pH с последующейэкстракцией этилацетатом.
В качестве метода количественного определенияиспользовался метод ВЭЖХ-МС/МС (внутренний стандарт – фенацетин).Использовалась колонка с неподвижной фазой С18 (100 мм × 2,1 мм; 3,5 мкм).Применялосьградиентноеэлюированиесиспользованиемвкачествекомпонентов подвижной фазы растворы муравьиной кислоты в воде иацетонитриле (0,1%) [60,64].Данная методика имеет ряд преимуществ по сравнению с ранееописанными«коктейльными»методамифенотипирования.Вчастности,дозировки используемых лекарственных веществ – субстратов в десятки разменьше соответствующих терапевтических доз.
Методика пробоподготовкипозволяет экстрагировать аналиты в одну пробу. Разработанная методика ВЭЖХМС/МС позволяет провести совместное количественное определение всехисследуемых веществ. Недостатками метода является использование плазмыкрови в качестве биообъекта, что позволяет использовать данную методикутолько в стационаре, а также использование лекарственных веществ, способныхвызвать нежелательные лекарственные являения (в частности, декстрометорфан).Описанный выше состав «коктейля» встречается в более поздних работах,посвященных разработке новых «коктейльных» методов фенотипирования.Ghassabian и соавторы изучали активность ферментов метаболизма у больныхшизофренией, используя «коктейль» аналогичного состава. Однако дозапринимаемых субстратов отличалась, в частности, размер дозы составлял 100 мгдля кофеина, 20 мг для омепразола, 25 мг для лозартана, 30 мг длядекстрометорфана и 2 мг для мидазолама [61,65,84].
Используемый биообъект –плазма крови. Пробоподготовка образцов проводилась с помощью жидкостьжидкостной экстракции ацетонитрилом (внутренний стандарт – фенацетин).Количественное определение проводилось с использованием метода ВЭЖХ-31МС/МС, неподвижная фаза – С18, подвижная фаза – растворы муравьинойкислоты в воде и ацетонитриле (0,1%); элюирование изократическое.Недостатком метода являюется достаточно высокие дозы субстратов (вчастности, доза мидазолама представляет собой 40% от средней дозы,оказывающей фармакологический эффект), а также использование плазмы кровив качестве биообъекта.«Коктейль» аналогичного состава использовался Tanaka и соавторами дляопределенияактивностиметаболизмауздоровыхдобровольцев[66].Пробоподготовка образцов проводилась методом твердофазной экстракции,который позволяет максимально очистить исследуемый образец плазмы отбелков, однако весьма трудоёмок и дорогостоящ (внутренний стандарт –нитразепам).
Количественное определение проводилось методом ВЭЖХ-МС/МС.Неподвижная фаза – С18, подвижная фаза – 10мМ раствор аммония ацетата в воде/ацетонитрил; элюирование градиентное. Недостатком является неширокаяраспространенностьпробоподготовкисиспользованиемплэйтаOstroTM,использовавшегося в процессе пробоподготовки образцов.Врезультатеобзоралитературыбылорешеноразработатьусовершенствованный «коктейльный» метод с использованием эндогенныхсубстратов и использованием мочи в качестве биожидкости для минимизациириска возникновения нежелательных лекарственных явлений и для уменьшениядискомфорта при отборе проб у пациента. Разрабатываемый метод позволитопределить активность изоферментов CYP1A2, CYP2C9, CYP3A4 и CYP2D6 сиспользованиемследующихпарсубстрат/метаболит:кофеин/параксантин(CYP1A2), лозартан/Е-3174 (CYP2C9), кортизол/6-β-гидроксикортизол (CYP3A4)ипинолин/6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидро-β-карболин(CYP2D6).Учитываяпериоды полувыведения исследуемых веществ и циркадные ритмы эндогенныхсоединений, наилучшим временем для отбора проб мочи является утренняя мочачерез 2 часа после перорального приёма 25 лозартана и 100 мг кофеина в моментпробуждения от сна.32В Таблице 2 приведены сводные данные по описанным в литературе«коктейльным» методам фенотипирования основных изоферментов цитохромаР450.33Таблица 2 – Описанные в литературе «коктейльные» методы фенотипирования основных изоферментов цитохромаP450Авторы, годИзоферментыизданияBing Zhu,CYP1A2Dong-ShengOu-Yang,CYP2E1Xiao-PingChen et al.,CYP2C192001.CYP2D6Субстраты, их дозировкаБиожидкостьМетодикаОсобенности методаи определяемый(методикаколичественногометаболитпробоподготовки)анализакофеин, 200 мгМоча, плазмаВЭЖХ-УФ, ВЭЖХ сМногоэтапная жидкостная(параксантин)крови (жидкостнаяфлуорометрическимэкстракция пархлороксазон, 200 мг (6-экстрация)детектированиемсубстрат/метаболит погидроксихлороксазон)отдельности из различныхмефенитоин, 100 мгбиожидкостей (моча,(4’гидроксимефенитоин)плазма).метопролол, 100 мг (aгидроксиметопролол)CYP3Aмидазолам, 7,5 мг (1’гидроксимидазолам)MagnusМоча, плазмаВЭЖХ-УФ, ВЭЖХ сМногоэтапная жидкостнаяChristensen,крови (жидкостнаяфлуорометрическимэкстракция парKatarinaэкстрация)детектированиемсубстрат/метаболит поAndersson, Perотдельности из различных34Продолжение Таблицы 2Dalen et al.,CYP1A22003.кофеин, 100 мгбиожидкостей (моча,(параксантин)плазма).CYP2C9лозартан, 25 мг (E-3174)CYP2C19омепразол, 20 мг (5гидроксиомепразол)CYP2D6дебризохин.
10 мг (4гидроксидебризохин)CYP3A4хинин, 250 мг (3гидроксихининSiwapornCYP1A2Chainuvati,Anne N.CYP2D6Nafziger, J.Steven LeederCYP2C19et al., 2003.CYP3Aкофеин, 2 мг/кгМоча, плазмаВЭЖХ-УФ, ВЭЖХ сМидазолам вводится(параксантин)крови (жидкостнаяфлуорометрическимвнутривенно;декстрометорфан, 30 мгэкстрация)детектированиемМногоэтапная жидкостная(декстрорфан)экстракция паромепразол, 40 мг (5-субстрат/метаболит погидроксиомепразол)отдельности из различныхмидазолам, 0,025 мг/кгбиожидкостей (моча,(1’-гидроксимидазолам)плазма).35Продолжение Таблицы 2CYP2C9варфарин, 10 мг (6гидроксиварфарин)Ophelia Q.P.CYP1A2кофеин, (параксантин)Моча, плазмаYin, SherryCYP2C9толбутамид (4-крови (ТФЭ)S.L. Lam,Cindy M.Y.
LoCYP2C19et al., 2004.CYP2D6CYP3AВЭЖХ-МС/МССовместная методика ТФЭопределяемых веществ изгидрокситолбутамид)биожидкости;омепразол (5-совместнаягидроксиомепразол)хроматографическаядебризохин (5-методика количественногогидроксидебризохин)определениямидазолам (1’гидроксизолам)JY Ryu, ISCYP1A2Song, YESunwoo et al.,CYP2C192007.кофеин, 93 мгМоча, плазмаВЭЖХ сМногоэтапная жидкостная(параксантин)крови (жидкостнаяфлуорометрическимэкстракция паромепразол, 20 мг (5-экстрация)детектированием,субстрат/метаболит поВЭЖХ-МС/МСотдельности из различныхгидроксиомепразол)CYP2D6декстрометорфан, 30 мгбиожидкостей (моча,(декстрорфан)плазма).36Продолжение Таблицы 2CYP2C9лозартан, 30 мг (E-3174)CYP3A4мидазолам, 2 мг (1’гидроксизолам)Kyung-Suk Oh,CYP1A2Su-Jin Park,кофеин, 10 мгПлазмаВЭЖХ-МС/МССовместное извлечение(параксантин)(жидкостнаяисследуемых веществ изэкстракция)плазмы крови;Dhananjay D.CYP2C9лозартан, 2 мг (E-3174)Shinde et al.,CYP2C19омепразол, 200 мг (5-Совместная методикагидроксиомепразол)количественногодекстрометорфан, 2 мгопределения исследуемых(декстрорфан)веществ в одной пробе2012CYP2D6CYP3A4мидазолам, 100 мг (1’гидроксизолам)37ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ (СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ)ГЛАВА 2.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ2.1. Физико-химические свойства исследуемых веществ1.КофеинХимическое название:1,3,7-триметил-1H-пурин2,6(3H,7H)-дионБрутто-формула:C8H10N4O2Молярная масса, г/моль:194,19Номер CAS:58-08-2Описание:Белый порошок или кристаллыбез запахаРастворимость:Умеренно растворим в воде,этаноле,легкорастворимвхлороформеLogP (октанол/вода):-0,07Форма выпуска:Растворыдлявведения(100;таблетки (100 мг)подкожного200мг/мл),382.ПараксантинХимическое название:1,7-диметил-1H-пурин2,6(3H,7H)-дионБрутто-формула:C7H8N4O2Молярная масса, г/моль:180,16Номер CAS:611-59-6Описание:Белый порошок или кристаллыбез запахаРастворимость:Практически не растворим вэтаноле,воде,растворимвметанолеLogP (октанол/вода):-0,200,1умеренноМNaOH,393.ЛозартанХимическое название:(2-бутил-4-хлор-1-{[2'-(1Hтетразол-5-ил)дифенил-4-ил]метил}-1H-имидазолl-5-ил)метанолБрутто-формула:C22H23ClN6OМолярная масса, г/моль:422,91Номер CAS:114798-26-4Описание:Желтоватыйкристаллическийпорошок без запахаРастворимость:ЛегкорастворимвметанолеLogP (октанол/вода):4,01Форма выпуска:Таблетки (25; 50; 100 мг)воде,404.Е-3174Химическое название:(2-бутил-4-хлор-1-{[2'-(1Hтетразол-5-ил)дифенил-4-ил]метил}-1H-имидазол-5-ил)-4карбоновая кислотаБрутто-формула:C22H21ClN6O2Молярная масса, г/моль:436,89Номер CAS:124750-92-1Описание:Белыйкристаллическийпорошок без запахаРастворимость:ЛегкометанолеLogP (октанол/вода):4,19растворимвводе,415.КортизолХимическое название:4-прегнен-11β,17α,21-триол3,20-дионБрутто-формула:C21H30O5Молярная масса, г/моль:362,46Номер CAS:50-23-7Описание:Белыйкристаллическийпорошок без запахаРастворимость:Практически не растворим вводе, легко растворим в этаноле,ацетонеLogP (октанол/вода):Средняяорганизме:концентрация1,61в 10-100 мкг в суточной моче;утром (6-8 ч) – максимальнаяконцентрации, вечером (20-22 ч)– минимальная концентрация426.6-β-гидроксикортизолХимическое название:4-прегнен-6,11β,17α,21-тетрол3,20-дионБрутто-формула:C21H30O6Молярная масса, г/моль:378,46Номер CAS:3078-34-0Описание:Белыйкристаллическийпорошок без запахаРастворимость:Практически не растворим вводе, легко растворим в этаноле,ацетонеLogP (октанол/вода):1,12437.ПинолинХимическое название:6-метокси-1,2,3,4-тетрагидро9Н-пиридо[3,4- β]индолБрутто-формула:C12H14N2OМолярная масса, г/моль:202,26Номер CAS:20315-68-8Описание:Желтоватыйкристаллическийпорошок без запахаРастворимость:Практически не растворим вводе, легко растворим в этаноле,ацетонеLogP (октанол/вода):Средняяорганизме:концентрация1,51в 2 нг/г – 21 мкг/г в различныхорганах448.6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидро-β-карболинХимическое название:6-метокси-1,2,3,4-тетрагидро9Н-пиридо[3,4- β]индолБрутто-формула:C12H14N2OМолярная масса, г/моль:202,26Номер CAS:20315-68-8Описание:Желтоватыйкристаллическийпорошок без запахаРастворимость:Практически не растворим вводе, легко растворим в этаноле,ацетонеLogP (октанол/вода):1,51452.2.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
