Диссертация (1141267), страница 11
Текст из файла (страница 11)
На вторую пластинку наносили в первуюточку 0,001 мл раствора Б полученного из клубней, во вторую точку 0,001 мл5% раствора глюкозы и хроматографировали восходящим способом вследующих системах растворителей: 1.96% этанол; 70% этанол; вода;изопропанол - вода (3:1), в эти системе растворителе не произошлоразделение глюкозу фруктозу и инулин.
На и лучше разделения прииспользование система растворителе изопропанол - вода (4:1).После прохождения фронтом тех или иных растворителей 12,5 см,пластинки вынимали из камеры, высушивали на воздухе и обрабатывалидетектирующимиреактивами:илиантроновымреактивом,илирезорциновым реактивом или дифениламиновым реактивом.Первую пластинку с полученной хроматограммой погружали в раствор 1антронового реактива, высушивали на воздухе, затем опрыскивали раствором2 антронового реактива и нагревали в сушильном шкафу при температуре1080С в течение 6 минут.
Реактив является специфичным на кетозы ипентозы. Моно, -ди, -три, полисахариды, содержащие кетогексозы, даютжелтую окраску, кетопентозы- пурпурную, кетогентозы- оранжево-желтую.66Наилучшееразделениенаблюдалосьприиспользованиисистемырастворителей изопропанол- вода (4:1) – извлечение из клубней дает пятножелтого цвета, совпадающее по значению Rf c пятном фруктозы (Rf 0,68).При опрыскивании хроматограммы резорциновым реактивом, так жеспецифическим на кетозы, с последующим нагреванием при температуре 900С в течение 10 минут, наблюдалось пятно розового цвета аналогичнойформы и расположения. Полученные результаты приведены на рис.18.▲▲12Рисунок.
18. Схема хроматограммы определение фруктозы1. – 5% раствор фруктозы,2. – извлечение из клубней,Подвижная фаза: изопропанол - вода (4:1)Проявитель: антроновый реактив.На основании полученных данных можно констатировать, что в клубняхтопинамбура присутствуют связанные углеводы.При опрыскивании хроматограммы второй пластинки дифениламиновымреактивом, специфичным для альдоз (альдогексозы дают коричневоеокрашивание, альдопентозы-пурпурное), извлечение из клубней топинамбурапятна серо-коричневого цвета, совпадающее по значению Rf с пятномглюкозы (Rf 0,61).
Полученные результаты представлены на рис.19.67▲▲12Рисунок.19. Схема хроматограммы определение глюкозы1. – 5% раствор глюкозы,2. – извлечение из клубней топинамбураПодвижная фаза: изопропанол - вода (4:1)Проявитель: дифениламиновый реактив.На рис. 19. видно, что свободные сахара содержатся в клубнях топинамбура.Приготовление реактивов1. Антроновый реактивСостоит из реактива 1 и реактива 2, которыми последовательнообрабатывалихроматографическиепластинки,реактивом1методомпогружения, затем реактивом 2 методом опрыскивания.1.1. Приготовление реактива 10,3 г антрона растворяют в 10 мл горячей кислоты уксусной.
Реактивиспользуют немедленно после приготовления.1.2. Приготовление реактива 2к 20 мл этилового спирта 96 % прибавляли 3 мл кислоты фосфорной(плотность 1,6) и 1 мл воды, перемешивали.2. Резорциновый реактивк 1 мл 95% этилового спирта прибавляли 9 мл 2 М раствора кислотыхлористоводородной,перемешивали.приготовляемом растворе.3. Дифениламиновый реактив0,1грезорцинарастворяютв68К 5 мл н - бутанола прибавляли 5 мл метанола, перемешивали.
0,5 гтрихлоруксусной кислоты растворяли в приготовленном растворе. 0,2 гдифениламина растворяли в приготовленном растворе трихлоруксусной кислоты.3.3.2. Качественный и количественный анализ углеводов клубнейтопинамбура методом ВЭЖХИсследовали качественный и количественный состав свободныхуглеводов в клубнях топинамбура заготовленных в Таджикистане, методомВЭЖХ. Свободные сахара определяли по следующей методике: к 100 мгизмельченного сырья добавляли 1 мл воды в пробирку объемам 5 мл сзавинчивающейся пробкой, нагревали при 90оС до набухания сырья иэкстрагировали углеводы в течение 1 часа при температуре 25 оС привстряхивании.
Полученное извлечение центрифугировали 10 минут при14000 об/мин, добавляли активированный уголь, встряхивали и сновацентрифугировали 10 минут при 14000 об/мин.20 мкл супернатанта анализировали методом прямофазной ВЭЖХ наколонке Luna 100 - 5 NH2 4,6 х 250 mm (5 мкм) или аналогичной с подвижнойфазой: ацетонитрил - вода (70:30) при скорости потока 1 мл/мин, прикомнатной температуре с рефрактометрической детекцией. Отношение пикови расчет концентраций проводили по внешнему стандарту, содержащемуF ile N a m eTypeP o in t s C o u n tD a te S ta m pD a teT it leS a m p lin g R a t eE :\A u to C h r o m 3 0 0 1 1 2 \C H - R ID \e d it\# 1 1 \R ID 1 A .c hH P LC16672 6 - F e b - 1 4 , 2 0 :1 9 :5 12 6 F e b 2 0 1 4 2 0 :3 1 :5 6L C D A T A F IL E1 3 8 .8 8 7 9смесь анализируемых углеводов в концентрации 10 г/л. На рис.20.S a m p le D a t aIn s t r u m e n tS a m p le ; 1 u L ;In s tr u m e n t 1 ; R I d e te c to r ; 0 .4 6 x2 5 c m C o lu m n K r o m a s il 1 0 0 - 5 N H 2 ( 5 u m ) , 2 5 ° C 1 m l/m inM o b ile P h a s e AM o b ile P h a s e BM o b ile P h a s e Cp H M o b ile P h a s e CM o b ile P h a s e DG r a d ie n t BG r a d ie n t CG r a d ie n t DW a te rM eC NW a te r ; 2 0 m M T B A - p h o s p h a te4M e C N /H 2 O ( 7 0 :3 0 v/v) ; 1 m M A m m o n iu m A c e ta te0B0C100Dпредставлена хроматограмма ВЭЖХ смеси стандартов 10 г/лR ID 1 A .c h4000s td350030002500s uc rosegluc os e1500fruc tos eGly c erol20000.000.00100050000N o.12341N am eG lyc e r o lf r u c to s eg lu c o s es u c ros e23456tRP e a k A r e a ( Y u n its /mA rse)a P e r c e n t4 .5 57 9 9 6 6 3 7 .0 0 02 5 .1 8 85 .9 87 8 6 3 4 0 8 .5 0 02 4 .7 6 86 .4 67 2 1 3 6 3 0 .0 0 02 2 .7 2 27 .4 08 6 7 4 1 9 0 .0 0 02 7 .3 2 278910Retention Time (min)Рисунок.
20. Хроматограмма смеси стандартов концентрации 10 г/л.69Рисунок. 21. Хроматограмма ВЭЖХ извлечения из клубней топинамбураКак показывают результаты исследования, в клубнях топинамбурасвободные сахара представлены фруктозой, глюкозой и сахарозой. Результатыколичественного содержания свободных сахаров представлены в табл.2.Таблица 2Результаты содержания свободных сахаров в клубнях топинамбура (n=5)Номеробразца1.2.3.Содержание сахаров, %Фруктоза0,51±0,0100,55±0,0110,49±0,009Глюкоза0,52±0,0100,57±0,0110,48±0,002Сахароза3,22±0,063,51±0,072,99±0,05Из табл.2.
видно, что в клубнях топинамбура содержится от 0,49 до0,55% фруктозы, от 0,48 до 0,57% глюкозы и от 2,99 до 3,51% сахарозы.Для анализа связанных сахаров к 100 мг измельченного сырья добавляли3 мл 1 М раствора хлористоводородной кислоты и проводили гидролиз при100 0С в течение 2,5 часов. Полученное извлечение центрифугировали 10минут при 14000 об/мин. К 0,8 мл супернатанта добавляли 7,2 мл воды.
5 млполученногорастворапропускаличерезобращеннофазныйконцентрирующий патрон (Диакарт C16), отбрасывая первые 3 мл и собираяследующий 1 мл.К 20 мкл раствора смеси стандартов в концентрации 1 г/л каждогоуглевода (внешний стандарт) и исследуемого раствора, добавляли 20 мкл70раствора внутреннего стандарта (раствор глюкозамина) и упаривали навакуумном центрифужном испарителе типа Speedvac с подогревом вполипропиленовой пробирке. К высушенной пробе добавляли 20 мкл 0,5 Мраствора РМР (1-фенил-3-метил-5-пирозалон) в метаноле и 20 мкл 0.3 Мрастворакалиягидроксида,тщательнотермостатировали при температуре 700встряхиваянаVotexииС в течение 2 часов.
Пробунейтрализовали 20 мкл 0.3 М раствором хлористоводородной кислоты идважды экстрагировали избыток экстрагента РМР 50 мкл бензола. Остатокупаривали на SpeedVac с подогревом и растворяют в 500 мкл смесиацетонитрил-вода(9:1).Полученнуюсмесьанализировалиметодомкапиллярного электрофореза на приборе для капиллярного электрофорезаApplied Biosistem 270Т с УФ - детекцией при длине волны 245 нм итемпературе 30 оС.Содержание связанных сахаров определяли с помощью той жепрограммы что и свободных сахаров, отношение пиков и расчетыконцентрации углеводов проводили по внутреннему (глюкозамину) ивнешнему стандарту смеси пяти анализируемых углеводов в концентрации 1Response800700600glucose-PMPd-xylose-PMPd-galactose-PMPd-arabinose-PMP900glucosamine-PMPdad1A.chd-mannose-PMPг/л. Результаты представлены на рис 22, 23 и в табл. 3.500400300200100051015R et ent ion Tim e (m in)20Рисунок.
22. Хроматограмма смеси стандартов с концентрацией 1 г/лNamed-mannose-PMPglucosamine-PMPglucose-PMPd-xylose-PMPd-galactose-PMPd-arabinose-PMPtR(min)4.896.518.609.319.9510.42Peak AreaArea Percent8.426e+617.45.332e+611.07.507e+615.59.891e+620.46.685e+613.88.621e+617.8g lu c o s a m in e -P M P71d a d 1 A .c h1608005d -a ra b in o s e -P M P240d -g a la c to s e -P M P32020g lu c o s e -P M P400d -x y lo s e -P M P480d -m a n n o s e -P M PR espon se56010Retention Time (min)152a mХроматограммаetR (min )P e a извлеченияk A rea A rea клубнейP e r c e n топинамбураtРисунок.N23.гидролизатаизd -m an n os e-P M Pg lu c o s a m in e - P M Pg lu c o s e - P M Pd - x y lo s e - P M Pd - g a la c t o s e - P M Pd - a r a b in o s e - P M P4 .8 86 .5 18 .5 69 .2 69 .8 81 0 .4 8838815.4.2.5.2.8.8783191882120eeeeee++++++4655540 .83 1 .98 .38 .01 .80 .6Результаты эксперимента показывают, что общие сахара представлены -маннозой, глюкозой, ксилозой, галактозой и арабинозой.
Результатыg lu c o s a m in e -P M Pколичественного содержания общих сахаров представлены в табл. 3d a d 1 A .c hТаблица 3Результаты содержания связанных сахаров в клубнях топинамбура(n=5)Галактоза0,44±0,0080,47±0,0090,43±0,008d -a ra b in o s e -P M PКсилоза0,46±0,0090,51±0,0100,43±0,008d -g a la c to s e -P M P160Глюкоза3,01±0,063,13±0,062,98±0,58d -x y lo s e -P M PМанноза0,007±0,000210,003±0,000120,005±0,00020g lu c o s e -P M P1.2.3203.240400Содержание сахаров, %d -m a n n o s e -P M PR espon se560Номеробразца480Арабиноза0,15±0,0030,19±0,0030,13±0,002Как80 показывают результаты табл.3 содержание маннозы колеблется от200,003 до 0,007%глюкоза от 52,98 до 3,13%; 10ксилозы от 0,4315до 0,51%;0Retention Time (min)галактозыотm 0,43до 0,47%;N aet R (арабинозыm in )P отe a 0,13k A rдоe a0,19%.A read -m an n os e-P M Pg lu c o s a m in e - P M Pg lu c o s e - P M Pd - x y lo s e - P M Pd - g a la c t o s e - P M Pd - a r a b in o s e - P M P4 .8 76 .5 18 .5 59 .2 59 .8 81 0 .4 7439813.9.2.6.0.8.7949220137817eeeeee++++++465554P erc en t0 .53 4 .71 0 .48 .62 .00 .43.4.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
