Диссертация (1141026), страница 12
Текст из файла (страница 12)
et al., 1997. Полученный в результате амплификациифрагмент в 176 пар нуклеотидов (п.н.) подвергали рестрикции эндонуклеазойBsoMA I («Сибэнзим», Новосибирск) в течение 16 час при 55˚С споследующим разделением фрагментов в 7,5 % полиакриламидном геле.«Дикая» гомозигота GSTP1Ile/Ile характеризовалась одной полосой 176 п.н.,66мутантная гомозигота GSTP1Val/Val двумя полосами 85 и 91 п.н., агетерозигота GSTP1Ile/Val – всеми тремя.Анализ результатов ПЦР-исследования.Разделение продуктов рестрикции проводилось в 8%-ном полиакриламидном геле методом вертикального электрофореза в течение 2-3-х часов.Состав для приготовления 30 мл 8% ПААГ: 8,4 мл 30% раствора АА (29:1), 1,5мл 10х буфера ТВЕ, до 30 мл дистиллированной воды, 600 мкл 10% аммонияперсуль-фата (APS), 26 мкл ТЕМЕД.В качестве контроля молекулярного веса ДНК использовали ДНКстандартного молекулярного веса pUC19/Msp1. Визуальный контроль пробегапроб ДНК проводили по ксиленцианолу и бромфеноловому синему.Окрашивание геля нитратом серебра для визуализации продуктов ПЦРпроводили по приведенной ниже методике.Окрашивание гелей проводили по усовершенствованной методикеLiberman.
После электрофореза гель инкубировали в растворе 0,011 М AgNO3в течение 10-15 минут, затем трижды промывали в дистиллированной воде.Проявление проводили в модифицированном растворе проявителя (увеличенаконцентрация НСНО) следующего состава: 0,75 M NaOH; 0,5 M HCHO;2,3mM Na(BH4) около 10-15 минут, в зависимости от интенсивностипроявления геля.2.3.2.
Метод определения уровней аутоантител к антигенам органовпищеваренияПроводилось исследование уровня аутоантител (АТ) в сыворотке кровиу пациентов с АД в основной группе и в группе сравнения - до начала леченияи в течение недели после окончания курса лечения. Исследование проводилосьв лаборатории «СМ-Клиника» - общество с ограниченной ответственностью«Лабораторно-диагностический центр» (ООО «ЛДЦ»), зав. лабораториейОмариева М.
А. В работе использованы наборы для определения аутоантителМИЦ «Иммункулус» (г. Москва).67Определение содержания аутоантител к тканевым антигенам позволяетсудить о наличии и степени выраженности патологических изменений висследуемых органах и тканях, а также контролировать эффективностьпроводимого лечения. Метод предназначается для выявления имеющихся илиначинающихся заболеваний и мониторинга их динамики с целью выявленияпатологических изменений со стороны органов пищеварения.Определение уровней аутоантител к антигенам органов пищеварения всывороткекровиосуществлялосьметодомтвердофазногоиммуноферментного анализа (ИФА), лежащего в основе методов группыЭЛИ-Тест (сокращение от ELISA - Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent-Assay).Данный метод позволяет выявить отклонения в сывороточных уровняхаутоантител класса IgG определенной антигенной специфичности.Проведение исследования с помощью данного метода предполагаетследующую последовательность: антигенные компоненты сорбируются натвёрдой фазе (в лунках полистироловом планшете) для выявления антител кним.
Затем к ним в лунки планшета добавляются биопроба (исследуемая пробасыворотки крови пациента) и контрольная сыворотка. Система подвергаетсяинкубации в течение определенного времени, в ходе которого частьспецифических антител из сыворотки пациента взаимодействует с антигеномна твердой фазе, не взаимодействующие компоненты отмываются, т.е., послеинкубации устанавливается равновесие между связанными и свободнымиантителами к соответствующим антигенам. Далее содержимое лунокудаляется и в них добавляется раствор конъюгата антивидовых (кроличьих)антител к IgG человека с пероксидазой хрена и и система вновь подвергаетсяинкубации.
Происходит сорбция молекул конъюгата в количестве, прямопропорциональном количеству связавшихся аутоантител; антивидовыеантитела взаимодействуют с определяемыми специфическими антителами иобразуют «сэндвич». После удаления избытка несвязанного конъюгата дляопределения активности пероксидазы проводится ферментативная реакция68пероксидазы с перекисью водорода в присутствии хромогена: в системудобавляется раствор перекиси водорода и бесцветного хромогенногосубстрата (тетраметилбензидина; ТМБ), который каталитически разлагаетсяпод действием конъюгата фермента с антивидовыми антителами собразованием окрашенного соединения, выявляемого визуально, либофотометрически.концентрацииИнтенсивностьантителвокраскианализируемомхромогенаобразце.пропорциональнаПослеостановкипероксидазной реакции стоп-реагентом оценка результатов проводитсяфотометрически при длине волны 450 нм.РезультатцветовойИФА-реакциирегистрируетсяспомощьюфотометра вертикального сканирования (ИФА-ридера).
Далее проводитсярасчет результатов относительной иммунореактивности определяемыхантител в пробах - определяется интенсивность реакции, которая оказываетсяпрямо пропорциональной количеству специфических антител в биопробе,выраженной в процентах от иммунореактивности контрольной сыворотки. Пооптической плотности растворов рассчитывается содержание антител вотносительных единицах (рис. 6).АГРисунок 6 - Принципиальная схема твердофазного неконкурентногоИФА, лежащего в основе методов группы ЭЛИ-Тест(Полетаев А.Б., Кузьменко Л.Г., 2006)69Средняя индивидуальная иммунореактивность каждого анализируемогообразцасывороткикровисовсемииспользуемымиантигенамирассчитывается по формуле:R (aгl) х 100СИР = (-------------- ----- ---- 100R (aг2) х 100+ ------------- -100 +R (К1)R (aг24) х 100-----------------------R (K2)+ 100) : NR (K24)где:СИР - средняя индивидуальная иммунореактивность сывороткиконкретного пациента, выраженная в процентах от среднепопудяционных(контрольных) значений,R (aгl, аг2, ...) - величина оптической плотности анализируемойсыворотки крови в лунках с антигенами - 1, 2 и т.д.R (к1, к2, ...) - величина оптической плотности контрольной сывороткикрови в лунках с антигенами - 1, 2 и т.д.N – количество исследуемых антигенов.Отклонения иммунореактивности анализируемого образца сывороткикрови с каждым из используемых антигенов (в процентах от среднегонормализованного уровня) рассчитываются по формуле:ОП (аг1) * 100R (норм) aгl = ( ------------ ) - 100 - СИРОП (к1)ОП (аг2) * 100R (HOPM) аг2 = ( ----------- ) - 100 - СИРОП (к2)ОП (аг2) * 100К (норм) аг2 = ( ----------- ) -100 - СИР,ОП (к2)где: R (НОРМ) aгl, аг2 и т.д.
- отклонения (в процентах от среднегонормализованного уровня) иммунореактивности анализируемого образцасыворотки крови с антигеном-1, антигеном-2 и т.д.ОП (аг1, аг2,...) - оптическая плотность реакции образца сывороткикрови с антигенами aгl, аг2 и т.д.ОП (к1, к2,....) - оптическая плотность реакции контрольной сывороткис антигенами aгl, аг2 и т.д.70СИР - средняя индивидуальная иммунореактивность сывороткиконкретного пациента, выраженная в процентах от среднепопуляционных(контрольных) значений. Для расчетов используется соответствующаякомпьютерная программа.Прииммунологическомисследованииу пациентов определялисывороточное содержание аутоантител класса IgG, направленных к рядуантигенов органов пищеварения:1) антитела - маркеры изменений в стенках желудка и тонкогокишечника:- АТ к мембранному антигену клеток стенки желудка (АT к GaM-02):изменения уровней антител к нему часто указывает на воспалительныеи дегенеративные изменения в стенке желудка;- АТ к мембранному антигену клеток к стенки тонкого кишечника (AT кItM-07), изменения уровней антител к нему часто указывает на наличиевоспалительных или дегенеративных изменений в стенке тонкогокишечника;2) антитела - маркеры изменений в ткани печени:- АТ к мембранному антигену митохондрий гепатоцитов (АТ к HMMP),изменения уровней антител к нему часто указывают на патологическиеизменения в паренхиме печени;Указанные антигены являются основными антигенами-мишенями,измененный синтез АТ к которым наблюдается при разных видах патологииорганов ЖКТ (язвенная болезнь, гастриты, колиты и др.), печени:иммуноактивации или иммуносупрессии (иммунодефицита).
При разныхформахорганнойпатологиинаблюдаютсяизменениясывороточногосодержания аутоантител к одному или нескольким антигенам той или инойорганной направленности, зависящей от локализации патологическогопроцесса.Полученные данные интерпретируются следующим образом: оптимум71значений среднего индивидуального уровня иммунореактивности в сравнениис контролем, рассчитанным, по формуле, находится в диапазоне от -20% до+10% от среднего уровня реакции контрольной сыворотки с используемымиантигенами, т.е. нормальные значения уровней АТ находятся в диапазоне -20до +10 отн. ед. Если средний индивидуальный уровень иммунореактивностиисследуемой сыворотки превышает +10 % от среднего уровня реакцииконтрольной сыворотки с используемыми антигенами - это указывает наполиклональную иммуноактивацию, типичную для острых инфекционныхзаболеваний, обострения хронических инфекций, воспалительных процессов,системных аутоиммунных болезней. Если средний индивидуальный уровеньиммунореактивности исследуемой сыворотки ниже -20 % от среднего уровняреакции контрольной сыворотки с используемыми антигенами - это указываетна поликлональную иммуносупрессию, типичную для массивных латентныхвнутриклеточных инфекций, хронических интоксикаций, иммунодефицитовлюбого происхождения.Наиболее информативно патологические изменения в организме могутотражаться в изменениях соотношений между АТ к разным антигенам.Методы группы ЭЛИ-Тест, направленные на одновременную количественнуюоценку изменений в содержании множества АТ, позволяют системно оценитьпарциальные изменения в содержании разных АТ.
Наиболее наглядно этодостигаетсяприанализегистограмм,отражающихотклоненияиммунореактивности АТ каждой специфичности, выраженные в процентах отиндивидуальногосреднегоуровнясывороточнойреактивности.Патологические изменения, происходящие в организме, отражаются визмененияхсывороточнойконцентрацииотдельныхАТ.Подъемотносительного содержания (иммунореактивности) тех или иных АТ выше20% от индивидуального среднего уровня следует рассматривать каквозможный индикатор имеющихся или формирующихся воспалительныхнарушений. Эти иммунологические изменения являются самым ранним72признаком начинающихся патологических органных изменений, которыелишь через несколько месяцев или даже лет могут достичь стадиихарактерных биохимических изменений (например, в виде повышения уровняглюкозы или содержания билирубина в сыворотке крови).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
