Диссертация (1141026), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Клинические методы исследованияВ каждом случае диагноз АД устанавливался на основании изученияжалобпациента,анамнезазаболевания,дерматологическогостатуса,определение индекса SCORAD и интенсивности зуда.Сбор анамнеза у всех пациентов проводился с использованиемспециально разработанной рабочей анкеты, позволявшей детально собрать истандартизировать анамнестические сведения по целому ряду параметров:время дебюта заболевания, острота и распространенность кожного процесса,частота рецидивирования обострений АД, эффективность и переносимость61проводимого ранее лечения. Наряду со специальным дерматологическимисследованием, учитывались перенесенные и сопутствующие заболевания,наследственнаяпредрасположенность,аллергологическийанамнез.Оценивался соматический статус пациента: перенесенные им соматическиеболезни, инфекции, хронические заболевания, имеющиеся в моментобследования, производственные факторы, негативно влияющие на здоровье.Особое внимание уделялось выявлению заболеваний, отнесенных катопическому маршу - аллергической риносинусопатии, бронхиальной астме,крапивнице, лекарственной непереносимости, рецидивирующему отекуКвинке.ФормулировкадиагнозаосуществляласьнаоснованииМеждународной классификации болезней 10-го пересмотра, принятой 43-ейВсемирной Ассамблеей Здравоохранения, введенной в действие натерритории Российской Федерации с 01.01.1999 (приказ М3 РФ от 27 мая1997№170).ДиагноздерматологическогоАДстатуса.базировалсяНаминаданныхиспользовалисьанамнезаидиагностическиекритерии J.
М. Hanifin и G. Rajka (1980) (при наличии 3 основных и 3дополнительных критериев), дополненные Б.Т. Глухеньким и С.А. Грандо(1990). Клиническую форму, стадию, распространенность кожного процессаи степень тяжести заболевания определяли в соответствии с рекомендациямив «Федеральных клинических рекомендациях по ведению пациентов сатопическим дерматитом» (2015) [37].Для оценки тяжести течения использовался индекс SCORAD (ScoringAtopic Dermatitis). Индекс SCORAD рассчитывался до и после лечения.Измерение индекса основывалось на оценке объективных (интенсивности ираспространённости кожных поражений) и субъективных (нарушению сна иинтенсивности кожного зуда) критериев.Для измерения интенсивности клинических проявлений проводилиоценку по 6 признакам: наличию эритемы, отёка или папул, сухости кожи62(оцениваемой на участках, лишенных высыпаний), лихенификации илишелушения, корок или мокнутия, экскориаций.
Каждый из соответствующихпризнаков оценивался по четырехуровневой шкале от нуля до трех баллов(при этом за 0 принималось отсутствие признака, 1 - признак слабо выражен,2 - признак выражен умеренно, 3 - признак резко выражен). Оценка признакапроизводилась на участке кожи с максимальной выраженностью признака,при этом для оценки интенсивности любого количества симптомов мог бытьиспользован один и тот же участок кожи.Для оценки площади поражения применялось правило «ладони» - когдаза единицу принималась площадь, равная ладонной поверхности кисти,составляющая около одного процента общей поверхности кожного покрова.При оценке площади поражения кожного покрова следует использоватьправило «девятки», в котором за единицу измерения принята площадьповерхности ладони пациента, эквивалентная одному проценту всейповерхности кожи; при этом поверхность шеи и головы принималась за девятьпроцентов, верхние конечности - по девять, нижние - по восемнадцать,промежность - один процент.Индекс SCORAD рассчитывался по формуле: SCORAD=A/5+7В/2+С,где за «А» принималась распространённость (площадь поражения кожи), за«В» принималась интенсивность выраженности клинических симптомов, за«С» - сумма баллов субъективных симптомов.
Значения индекса варьируют от0 (нет проявлений заболевания) до 103 баллов (при максимально тяжёломтечении АД). При этом в исследовании за легкое течение принималосьзначение индекса от 0 до 20 баллов, среднетяжелое течение - от 20 до 40баллов, тяжелое - выше 40 баллов. В исследование вошли пациенты с легкими среднетяжелым течением АД, что соответствовало величине индексаSCORAD от 0 до 40 баллов.Зудоценивалсяподесятибалльнойсубъективнойшкале.Незначительный - зуд, возникающий периодически и не являющийся63мучительным и доминирующим симптомом заболевания (0-1-2 балла).Умеренный - зуд, беспокоящий пациентов практически постоянно, имеющийчаще всего локализованный характер и редко нарушающий ночной сон (3-6баллов). Интенсивный, постоянный - зуд, носящий биопсирующий характер,вызывающий психоэмоциональное перенапряжение и бессонницу (7-10баллов).
Субъективные симптомы имели диапазон от нуля до десяти баллов иоценивались усреднено за последние трое суток. Таким образом, сумма балловсубъективных симптомов могла колебаться от нуля до двадцати баллов.Оценка эффективности проводимого лечения, период наблюдения запациентами, вошедшими в исследование, определялась не менее, чем 12 - 18месяцев после окончания курса лечения.
Состояние пациентов оценивалось доначала лечения (1-й визит), каждые 7 дней в течение лечения (2 и 3-й визиты),в течение 5-7 дней после его окончания (4-й визит), затем через 1, 3, 6, 9, 12 и18 месяцев после окончания лечения (соответственно, 5 - 10-й визиты). Крометого, о признаках обострения кожного процесса пациенты имели возможностьсообщить по телефонной связи, после чего приглашались на внеплановыйвизит.Критерием клинической эффективности лечения являлось уменьшениепоказателей индекса SCORAD: на 80% и более от исходного показателярасценивалось как достижение клинической ремиссии; на 50-80 % значительное улучшение; на 30-50% - улучшение; менее 30% - отсутствиеэффекта.2.3. Лабораторные методы исследованияПеред началом лечения всем пациентам проводилось общеклиническоеобследование,включающееклиническиеанализыкровиимочи,биохимический анализ крови, определение общего уровня IgE в сывороткекрови.642.3.1.
Методика молекулярно-генетического тестирования геновGSTM1, GSTT1 и GSTP1Молекулярно-генетическое тестирование генов GSTM1, GSTT1 и GSTP1проводили пациентам основной группы (52 человека) на базе лабораторииэпигенетики ФГБНУ «Медико-генетический центр» (зав. лабораторией проф. В.В.Стрельников) по протоколам лаборатории.Выделение ДНК из лимфоцитов периферической крови.Для выделения ДНК из лимфоцитов периферической крови к 700 мклразмороженной венозной крови обследуемых пациентов добавляли 700 мклбидистиллированной воды и центрифугировали в течение 15 мин соскоростью 12 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость удаляли, оставшийсяосадок пипетировали в 1000 мкл бидистиллированной воды, затем еще разцентрифугировали 15 мин со скоростью 12 тыс.
об/мин. Полученный осадокснова пипетировали в 270 мкл 0,2М р-ра ацетата натрия. Добавляли 30 мкл10% р-ра SDS (додецилсульфат натрия) и осторожно перемешивалипереворачиванием. Затем добавляли 300 мкл насыщенного раствора NaCl, иинтенсивно перемешивали содержимое пробирки, к полученной смесидобавляли 200 мкл хлороформа и снова интенсивно перемешивали. Затемфазы разделяли центрифугированием 15 мин со скоростью 12 тыс. об/мин. иотбирали супернатант в отдельную пробирку. К супернатанту добавлялидвукратный объем этанола и выдерживали образец в течение 30 мин притемпературе - 20°С. Пробу центрифугировали в течение 15 мин со скоростью12 тыс. об/мин., затем промывали осадок 70%-ным этанолом.
Полученныйосадок ДНК высушивали и растворяли в 150 мкл деионизированной воды.Определение полиморфизмов генов GSTM1 и GSTT1.Реакционная смесь (25 мкл) при анализе полиморфизма GSTM1содержала следующие компоненты: 1-2 мкл растворенной ДНК, 2.0 мМMgCl2, 1.5 мМ каждого dNTP, по 2 пмоль прямого (F) и обратного (R)праймеров, 1 ед. термостабильной Taq-полимеразы, 5 мкл 5-кратного буфера65для ПЦР («Интерлабсервис», Москва) и 0,2 мкг исследуемой ДНК,деионизированной воды до 25 мкл. Реакция амплификации проводилась сиспользованием термоциклера «Терцик» («ДНК-технология», Россия), вследующем режиме термоциклирования: 1-ый цикл - разделение цепей ДНКпри 94С (5 мин), 2-ой и последующие 33 цикла - 94С (1 мин), 60С (1,3 мин),72С (2 мин), далее полимеразная реакция при 72С (5 мин).
В качестве контроляПЦР использовали праймеры на последовательность гена HBB.При анализе GSTT1 реакционная смесь (25 мкл) содержала следующиекомпоненты: 1-2 мкл растворенной ДНК, 2.0 мМ MgCl2, 1.5 мМ каждогоdNTP, по 2 пмоль прямого (F) и обратного (R) праймеров, 1 ед.термостабильной Taq-полимеразы, 5 мкл 5-кратного буфера для ПЦР(«Интерлабсервис», Москва), деионизированной воды до 25 мкл. Реакцияамплификации проводилась с использованием термоциклера «Терцик»(«ДНК-технология», Россия), в следующем режиме термоциклирования: 1-ыйцикл - разделение цепей ДНК при 94С (5 мин), 2-ой и пследующие 33 цикла 94С (1 мин), 62С (1,3 мин), 72С (2 мин), далее полимеразная реакция при 72С(5мин).ВкачествеконтроляПЦРиспользовалипраймерынапоследовательность гена HBB.Оба метода различали гомозиготную делецию генов GSTМ1 и GSTТ1(нуль-генотип, GSTМ1 «-» и GSTТ1 «-») от гетерозигот и «диких» гомозигот,которые объединялись как «плюс-генотип» (GSTМ1 «+» и GSTТ1 «+»).Определение полиморфизма гена GSTР1.Ile105/Val105-полиморфизмGSTP1определялиспомощьюполимеразной цепной реакции с последующим рестрикционным анализом пометоду Harries L.W.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
