Диссертация (1140935), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Чевари, И. Чаба, Й. Секей [32].Метод основан на способности СОД конкурировать с нитросиним тетразолием(НСТ) за супероксиданионы, образующиеся в результате аэробного взаимодействиявосстановленной формы НАД и феназинметасульфата (ФМС). В результате этойреакции НСТ восстанавливается с образованием гидразин-тетразолия, количествокоторого определяли по оптической плотности на спектрофотометре «СС – 104»(Россия) при длине волны 540 нм против воды.
Использовали реактивы фирмы«Технология-Стандарт», (Барнаул: 1) реагент № 1: ЭДТА 0,ЗЗмМ (НСТ - 0,41мМ),(ФМС - 0,01 мМ); 2) реагент № 2: 0,8мМ НАДН в трис-ЭДТА буфере pH=8,0.К 0,05 мл сыворотки крови добавляли 2,0 мл реагента № 1, измеряли оптическуюплотность при длине волны 540 нм (Е1), затем добавляли 0,1 мл реагента №2,перемешивали и инкубировали 10 минут при температуре 25 °С в темноте и повторноизмеряли оптическую плотность (Е2). Параллельно ставили нулевую пробу, покоторой определяли оптическую плотность 2 мл для реагента №1 сразу (E0l) и через10 минут (Е02) и вычисляли разность между ними (ΔЕ0).Е :гдеЕО ЕПР100% ,Е 50ΔЕО - разность между E0l и Е02; ΔЕПР - разность между Е1 и Е2.62Заединицуактивностипринимали50%-ноеторможениереакциивосстановления НСТ, активность фермента выражали в условных единицах на 1мл сыворотки (у.е./мл).Определение активности каталазы в сыворотке крови крыс по методуКоролюка М.А.
и соавт. в модификации Коробейниковой Э.Н [16, 28]. Методоснован на способности перекиси водорода образовывать с солями молибденастойкий окрашенный продукт жёлтого цвета. В опытной пробе к 2 мл 0,03%раствора перекиси водорода добавляли 0,1 мл сыворотки.
Для проведенияхолостой пробы к 2 мл 0,03% раствора перекиси водорода добавляли 0,1 млдистиллированной воды. Контрольная проба: 2 мл 0,03% раствора перекисиводорода. Все пробы инкубировали в темноте при комнатной температуре втечение 10 мин,затем добавляли 1 мл 4% молибденовокислого аммония ина спектрофотометре «СФ – 104» (Россия) измерялиинтенсивность окраскиопытной, контрольной и холостой проб против дистиллированной воды придлине волны 410 нм. Результат выражали в мкат/л.Расчёт: А = (Е х – Е оп) • К • 1000 / 0,1 • 600,где А – активность каталазы в мкат/л;Е х – показания прибора для холостой пробы;Е оп – показания прибора для опытной пробы;К-коэффициент молярной экстинкции перекиси водорода = 22,2 • 10-3 мМ-1см-1;1000 – коэффициент перевода мл в л; 0,1 – объём опытного образца; 600 –время инкубации в секундах.2.3.3. Статистические методыСтатистическую обработку результатов проводили с использованием пакетаприкладных программ «Statistica v.
8.0 for Windows». Характеристика выборокпредставлена в формате «М±m», где М-среднее арифметическое значение признака, mстандартная ошибка среднего. Проверку статистических гипотез в группах проводили сиспользованием непараметрических критериев (Н - Краскела-Уоллиса, U – Манна-63Уитни, WW – Вальда-Вольфовитца, парного критерия Вилкоксона). Для выявлениясвязи между изучаемыми параметрами использовали коэффициент корреляцииСпирмена (R).
Отличия считали статистически значимыми при р<0,05.64Глава 3Результаты собственных исследований и их обсуждение3.1. Иммунный статус у больных с хронической почечной недостаточностью,находящихся на гемодиализе3.1.1. Врожденный иммунитет у больных хронической почечнойнедостаточностью, находящихся на гемодиализеВрожденный иммунитет у больных ХПН исследовали по клеточномусоставу, показателям функциональной активности фагоцитов в периферическойкрови иСодержанию компонентов комплемента в сыворотке.При оценке лейкоцитарной формулы у больных ХПН до процедурыгемодиализавыявленозначимоеувеличениеотносительногосодержанияэозинофилов, нейтрофилов за счет сегментоядерных форм, а также уменьшениесодержания лимфоцитов (таблица 3).
Процедура гемодиализа не оказываетзначимоговлияниянасодержаниепопуляцийлейкоцитоввкровивотносительных величинах. Общее количество лейкоцитов в периферическойкрови у больных ХПН до процедуры гемодиализа значимо снижено по сравнениюс контрольной группой за счет уменьшения абсолютного количества лимфоцитов(таблица 4).
У больных ХПН после сеанса гемодиализа общее количестволейкоцитов увеличивается за счет сегментоядерных нейтрофилов и лимфоцитов,однако данный факт является следствием гемоконцентрации, а не истинногоизменения количества лейкоцитов в крови.Показатели врожденного иммунитета у больных ХПН представлены втаблице 5. До сеанса гемодиализа поглотительная способность фагоцитовзначимо не отличается от показателей контрольной группы.
Изменяютсяпоказателикислород-зависимогометаболизмавнейтрофилах,возрастаетактивность и интенсивность спонтанного НСТ-теста. Отмечается значимое65снижение функционального резерва нейтрофилов по показателям активности иинтенсивности НСТ-теста. У больных ХПН до процедуры гемодиализа выявленоповышение лизосомальной активности нейтрофилов и концентрации в сывороткеС3 компонента комплемента в сравнении с контрольной группой. Процедурагемодиализанеоказываетзначимоговлияниянакислород-зависимыйметаболизм, функциональный резерв нейтрофилов, лизосомальную активностьнейтрофиловпериферическойкровииконцентрациюС3компонентакомплемента в сыворотке.Таблица 3 - Количественный состав лейкоцитов (%) в периферической крови убольных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе(M ± m)ПоказателиЭозинофилы, %Группа 1Группа 2Группа 3КонтрольХПН до диализаХПН после диализа(n=24)(n=45)(n=45)1,83±0,323,16±0,442,53±0,39р1-2<0,01(U)Нейтрофилы2,33±0,531,71±0,291,73±0,2754,33±1,0074,40±0,8372,27±1,10р1-2<0,001(U)р1-3<0,001(U)76,08±0,7574,02±1,04р1-2<0,001(U)р1-3<0,001(U)13,15±0,6615,31±0,99р1-2<0,001(U)р1-3<0,001(U)7,58±0,428,16±0,51п/ядерные, %Нейтрофилыс/ядерные, %Нейтрофилы всего, %Лимфоциты, %Моноциты, %56,67±1,0433,33±1,058,17±0,55Примечание.
р - показатель значимости различий между группами по критериямКраскела-Уоллиса и Манна-Уитни66Таблица 4 - Количественный состав лейкоцитов (• 109/л) в периферической кровиубольныххроническойпочечнойнедостаточностью,находящихсянагемодиализе (M±m)ПоказателиЛейкоциты, • 109/лГруппа 1Группа 2Группа 3КонтрольХПН до диализаХПН после диализа(n=24)(n=45)(n=45)6,20±0,245,31±0,256,35±0,34р1-2<0,01(U)р2-3<0,05(U)Эозинофилы, • 109/л0,11±0,020,17±0,030,16±0,03Нейтрофилы0,15±0,030,09±0,020,10±0,023,41±0,193,96±0,194,62±0,27п/ядерные, • 109/лНейтрофилы с/ядерные,• 109/лр1-3<0,01(U)Нейтрофилы всего, •3,55±0,194,06±0,20109/л4,72±0,27р1-3<0,01(U)Лимфоциты, • 109/л2,04±0,070,68±0,040,96±0,09р1-2<0,001(U)р1-3<0,001(U)р2-3<0,01(U)Моноциты, • 109/л0,49±0,030,41±0,030,50±0,04Примечание. р - показатель значимости различий между группами по критериямКраскела-Уоллиса и Манна-УитниПолагаем, что одной из причин усиления кислород-зависимого метаболизманейтрофилов в периферической крови может выступать снижение инактивацииАФК ферментом СОД, так как метаболиты, накапливающиеся в крови при ХПН,могут вызывать блокаду этого фермента [241].
Кроме того, генерацию АФКнейтрофилами при ХПН может стимулировать повышение концентрации в кровиметилглиоксаля[230,327].УвеличениеконцентрацииС3компонентакомплемента в сыворотке, вероятно, связано с нарушением его элиминации черезпочки.Крометого,возможнаактивациясистемыкомплементапо67альтернативному пути вследствие контакта крови с компонентами диализнойсистемы [351].Таблица 5 – Показатели врожденного иммунитета у больных хроническойпочечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе (M±m)ПоказателиГруппа 1Группа 2Группа 3КонтрольХПН доХПН после(n=24)диализа (n=45)диализа (n=45)Активность фагоцитоза, %49,33±2,1446,56±2,1746,49±1,88Интенсивность фагоцитоза,1,30±0,091,20±0,091,15±0,08Фагоцитарное число, у.е.2,69±0,192,49±0,112,42±0,11НСТ-тест спонтанный,19,00±2,6028,47±1,7826,58±1,89р1-2<0,005(U)р1-3<0,01(U)0,43±0,030,45±0,03р1-2<0,01(U)р1-3<0,01(U)у.е.активность, %НСТ-тест спонтанный,0,35±0,05интенсивность, у.е.НСТ-тест инд., активность, %27,67±2,7322,51±1,7725,73±1,52НСТ-тест инд.,0,47±0,050,35±0,030,43±0,031,46±0,110,79±0,080,97±0,09р1-2<0,01(U)р1-3<0,01(U)0,81±0,060,96±0,07р1-2<0,01(U)р1-3<0,01(U)293,81±10,62299,10±12,40р1-2<0,01(U)р1-3<0,01(U)0,89±0,020,88±0,02р1-2<0,01(U)р1-3<0,01(U)0,12±0,020,13±0,02интенсивность, у.е.Функц.
резерв (активностьНСТ-теста)Функц. резерв1,34±0,09(интенсивность НСТ-теста)Лизосомальная активность241,17±9,53нейтрофилов, у.е.С3, мг/млС5, мг/мл0,76±0,020,10±0,01Примечание. р - показатель значимости различий между группами по критериямКраскела-Уоллиса и Манна-Уитни683.1.2. Адаптивный иммунитет у больных хронической почечнойнедостаточностью, находящихся на гемодиализеИзучение популяционного состава лимфоцитов в периферической крови убольных ХПН выявило снижение в относительных величинах количества Тлимфоцитов (CD3+), Т-цитотоксических лимфоцитов (CD4+), Т-хэлперов (CD8+),натуральных киллеров (CD16+), В-лимфоцитов (CD20+) до и после процедурыгемодиализа; изменений количества лимфоцитов с маркерами адгезии (CD11b+),лимфоцитов с маркерами ранней активации (CD25+), с маркерами позднейактивации (HLA-DR+) и лимфоцитов с маркерами готовности к апоптозу (CD95+)не обнаружено (таблица 6).
Уменьшение количества CD4+ и CD8+ клетокравнозначное, поэтому иммунорегуляторный индекс (CD4/CD8) не изменяется посравнению с группой контроля. В абсолютных величинах до сеанса гемодиализапри сравнении с контрольной группой уменьшается содержание в крови всехисследуемых популяций лимфоцитов (таблица 7). После процедуры гемодиализавыявлено статистически значимое увеличение концентрации в крови CD8+ иHLA-DR+ лимфоцитов, а также увеличение на правах тенденции другихсубпопуляций лимфоцитов, что обусловлено гемоконцентрацией вследствиесопутствующего диализу процесса ультрафильтрации, а не истинного увеличенияколичества клеток в крови.Патогенез лимфоцитопении у больных ХПН является многофакторным.Имеют значение снижение пролиферации и дифференцировки лимфоцитов,усиление гибели лимфоцитов, что ранее было продемонстрировано у исследуемойкатегории больных [23].
У больных ХПН отмечается нарушение про- иантиапоптогеннойрегуляциивсвязисоснижениемэкспрессииантиапоптогенного белка Bcl-2 [133]. Отмечается усиление иммунологическогостарения Т-лимфоцитов у больных с ХПН [63, 223]. Указанные механизмыреализуютсявусловияхгиперазотемии,накоплениядругихпродуктовметаболизма, анемии, нарушения белкового, кальциево-фосфорного обменов,69изменения цитокинового профиля в крови, процессов свободно-радикальногоокисления и других факторов [8, 46, 62, 113, 318].Таблица 6 - Популяционный состав лимфоцитов (%) периферической крови убольных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе(М±m)ПоказателиCD3+, %CD4+, %CD8+, %Группа 1Группа 2Группа 3КонтрольХПН до диализаХПН после диализа(n=24)(n=45)(n=45)61,58±2,9152,89±2,8252,91±2,92р1-2<0,05(U)р1-3<0,05(U)37,56±2,1934,02±2,25р1-2<0,05(U)р1-3<0,01(U)28,33±1,3128,62±1,60р1-2<0,01(U)р1-3<0,01(U)43,83±1,8336,17±1,73CD4/CD81,29±0,101,37±0,081,22±0,06CD11b+, %18,75±1,6818,09±1,3616,80±1,24CD16+, %21,42±2,4316,33±1,0815,29±0,96р1-2<0,05(U)р1-3<0,05(U)16,29±1,3615,11±0,99р1-2<0,05(U)р1-3<0,01(U)CD20+, %21,50±1,50CD25+, %13,83±0,9414,78±0,9513,96±0,97HLA-DR+, %19,80±1,8416,32±1,1017,94±1,34CD95+, %23,75±2,3626,56±2,2225,36±1,95Примечание.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
