Диссертация (1140935), страница 10

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 10)

Результат выражали в граммах белка на 1 л биологической жидкости(г/л).Th2-зависимыйиммунныйответисследовалипоколичествуантителообразующих клеток (АОК) в селезенке крыс, иммунизированныхаллогенными эритроцитами, по A.J. Cunningham [6]. Крыс наркотизировалидиэтиловым эфиром, иммунизировали внутрибрюшинной инъекцией аллогенныхэритроцитов. Для иммунизации использовали 10% взвесь эритроцитов барана в0,9% NaCl (1 мл суспензии содержит 109 клеток), взвесь вводили в объеме 1 мл на100 г массы тела (доза 107 эритроцитов на 1 г массы).

Через 5 дней послеиммунизации животных забивали, извлекали и взвешивали селезенку, отделяли оторгана фрагмент массой 30 мг. Полученную навеску с помощью стеклянногогомогенизатора растирали в среде 199, которую добавляли из расчета 1 мл на 3 мгткани. Гомогенат фильтровали, добавляли 0,1 мл 10% взвеси аллогенныхэритроцитов и 0,1 мл 20% раствора комплемента (1:1:1), перемешивали изаполняли камеры, инкубировали 90 мин. в термостате при 37°С.

Использоваликамеры из предметных и покровных стекол, по методу Волчегорского И.А. [6]. Спомощью лупы подсчитывали в камерах число бляшек гемолиза. Абсолютноесодержание АОК в селезенке вычисляли по формуле:3 · количество бляшек в чашке · А · С · В · D, где3 – коэффициент разведения гомогената навески при смешивании с суспензиейаллогенных эритроцитов и раствором комплемента;А - масса селезенки;В - масса навески органа;С – объем гомогената навески;D – объем камеры.Th1-зависимыйгиперчувствительностиаллогеннымииммунныйзамедленногоэритроцитами.ответтипаИнтенсивностьисследовалиукрыс,реакциипореакциииммунизированныхГЗТоценивалипо57выраженности воспалительного отека стопы, в которую вводили аллогенныеэритроциты, использовавшиесядля предварительной иммунизации.Крысиммунизировали эритроцитами барана.

Через 4 суток после иммунизации крыснаркотизировали диэтиловым эфиром и вводили разрешающую дозу эритроцитовбарана (107 клеток на 1 г массы тела) в подошвенную поверхность стопы. Дляинъекции использовали отмытые эритроциты барана (1010 клеток / мл), вводилииз расчета 0,1 мл на 100 г массы тела. В контрольную стопу вводилиэквиобъёмное количество 0,9% NаCl. Через 24 часа после инъекции разрешающейдозыэритроцитов баранааккуратнорассекаликрыс умерщвлялиголеностопныесуставыцервикальнойиотделялидислокацией,обестопы.Волюмометрическим методом определяли объем обеих стоп. Интенсивность ГЗТрассчитывали как разность между объемом стопы, в которую вводили ЭБ, иобъемом стопы, в которую вводили 0,9% NаСl.2.3.1.3.

Определение концентрации некоторых цитокинов в плазме кровичеловека и крысОпределение концентрации цитокинов в плазме крови человека: ИЛ-1β,ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-8, ИЛ-10, ТНФ-α, ИФН-γ, проводили на автоматическомиммуноферментном анализаторе «Personal LAB» (Италия) с применением тестсистем фирмы «Вектор-Бест» (Россия). Уровень цитокинов выражали в пг/мл.Определение концентрации цитокинов в плазме крови крыс: ИЛ-1β,ИЛ-4, ИФН-γ, проводили на автоматическом иммуноферментном анализаторе«Personal LAB» (Италия), с применением специфических крысиных тест-системфирмы «Cloud-clone» (США). Уровень цитокинов выражали в пг/мл.2.3.1.4 Исследование апоптоза лимфоцитовЛимфоциты из периферической крови человека и крыс выделяли надвойном градиенте плотности фиколла и урографина, как описано выше.

Апоптоз58лимфоцитов оценивали на проточном цитофлуориметре «Navios» («BeckmanCoulter»,США)сиспользованиемтестсистемысокрашиваниемконъюгированным с флюорохромом аннексином V (Annexin-5-FITC) и 7аминоактиномицином D (7-AAD) из набора «Annexin 5 - FITC/7-AAD kit»(«Beckman Coulter», США). Дифференцировали интактные клетки (Annexin-5FITC–/7-AAD–), клетки с ранними признаками апоптоза (Annexin-5-FITC+/7AAD–), клетки с поздними признаками апоптоза и частично некротическиеклетки (Annexin-5-FITC+/7-AAD+).Перед окрашиванием клетки ресуспензировали в 1 мл охлажденном на льдуфосфатно-солевом буфере, затем центрифугировали 7 мин при 1500 об/мин, послечегосливалинадосадочнуюжидкость.Ксуспензииклетокдобавлялиохлажденный на льду 1% раствор фиксирующего буфера (1X Binding Buffer) израсчета 5·105 – 5·106 клеток/мкл. Затем к 100 мкл клеточной суспензии добавляли5 мкл Аnnexin V-FITC и 5 мкл ДНК – тропного красителя 7-AAD (BeckmanCoulter, США), клетки вортексировали и инкубировали в темноте в течение 15мин при 4 °С.

После инкубации к клеткам добавляли 400 мкл 1% фиксирующегобуфера (1X Binding Buffer) и проводили анализ клеток после 30 мин инкубации втермостате при 37°С на проточном цитофлюорометре. Результат выражали в %.2.3.2 Биохимические методы исследованияКонцентрацию паратиреоидного гормона в человеческой сывороткекрови определяли методом иммуноферментного анализа на автоматическомиммуноферментном анализаторе «Personal LAB» (Италия) с помощью тестсистемы фирмы «Biomerica» (США), результат выражали в пг/мл.Концентрацию паратиреоидного гормона в сыворотке крови крысопределялиметодомиммуноферментногоанализанаавтоматическомиммуноферментном анализаторе «Personal LAB» (Италия) с использованиемспецифической для крыс тест-системы компании «Cloud-clone» (США).

Результатвыражали в пг/мл.59Концентрацию неорганического фосфора в сыворотке крови человека икрысопределялинабиохимическиманализаторе«Analette»(США)сиспользованием тест-системы фирмы «Вектор-бест» (Россия) методом бездепротеинизации с молибденовокислым аммонием. Результат выражали вммоль/мл.Концентрацию общего кальция в сыворотке крови человека и крысопределяли на автоматическом, биохимическом анализаторе «Analette» (США) сиспользованием тест-систем фирмы «Вектор-бест» (Россия) методом с окрезолфталеинкомплексоном. Результат выражали в ммоль/мл.Определение веществ низкой и средней молекулярной массы влимфоцитах и плазме крови крыс по методу Кирковский В.В., Моин В.М.,Лобачева Г.А.

1994 г. [14].Метод основан на способности осаждения высокомолекулярных белковплазмы крови под действием хлорной кислоты и этилового спирта с последующейфотометрией на спектрофотометре «СС – 104» (Россия) при длине волны 210 нм.В центрифужную пробирку помещали 0,5 мл плазмы крови, добавляли 0,5мл раствора хлорной кислоты, тщательно перемешивали встряхиванием иоставляли при комнатной температуре на 10 мин, затем центрифугировали при3 000 об/мин в течение 10 мин.

Отбирали 0,5 мл надосадочной жидкости впробирку, в которую добавляли 0,1 мл раствора углекислого калия. Пробиркувыдерживали в ледяной бане в течение 20 мин, затем центрифугировали при 3 000об/мин 10 мин. К 0,2 мл надосадочной жидкости добавляли 0,8 мл этанола,встряхивали и оставляли на 10 мин при комнатной температуре, затемцентрифугировали 10 мин при 3 000 об/мин для осаждения высокомолекулярныхпримесей. Отбирали 0,5 мл надосадочной жидкости и добавляли к ней 4,5 млдистиллированной воды. После перемешивания фотометрировали при длиневолны 210 нм относительно контрольной пробы.Для постановки контрольной пробы смешивали 0,2 мл дистиллированнойводы и 0,8 мл этилового спирта, к 0,5 мл этого раствора добавляли 4,5 млдистиллированной воды.

Расчёт концентрации ВНиСММ проводили путем60умножения показателя оптической плотности пробы при длине волны 210 нм на3,94 – коэффициент пересчёта результата в г/л с учётом разведений плазмы.Результат выражали в г/л.Содержаниеизопропанол-игептан-растворимыхпервичных,вторичных и конечных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) вплазме, в лимфоцитах по методике Волчегорского И.А.

и соавторов [5,6,19].Использовалиэкстрационно-спектрофотометрическийметодопределенияпродуктов ПОЛ в цельной крови адаптированный к супернатантам лимфоцитов.К 0,5 мл субстрата добавляли 5 мл смеси гептан – изопропонол, встряхивали взакрытых пробирках 15 минут, центрифугировали при 10 000 об/мин, липидныеэкстракты сливали и разбавляли 5 мл смеси гептан – изопропанола (3:7) пообъему. Последнюю процедуру выполняли с целью достижения оптимальныхзначений оптической плотности в обеих фазах экстракта. К разбавленнымлипидным экстрактам добавляли водный раствор соляной кислоты (рН 2,0) вобъеме 2 мл для разделения фаз и отмывки от нелипидных примесей.

Послеотделения гептановую фазу отбирали в отдельную сухую пробирку, а к водноспитровой фазе добавляли 1 г NaCl для обезвоживания изопропонольногоэкстракта. После отделения водной фазы изопропонол переносили в отдельнуюпробирку. Оптические контроли готовили путем экстракции по схеме, описаннойвыше (0,5 мл 0,1% раствора ЭДТА на 0,9% NaCl).Измеряли оптическую плотность каждой фазы против соответствующегоконтроля при 220 нм (в диапазоне 186 – 225 нм изолированные двойные связи),232 нм (поглощение отражает содержание диеновых конъюгатов), 278 нм(поглощение зависит от содержания кетодиенов и сопряженных триенов).Конечные продукты ПОЛ (основания Шиффа) определяли путем дополнительногозамера оптической плотности экстракта при 400 нм.Расчет содержания продуктов ПОЛ проводили, соотнося величинысоответствующих экстинкций к количеству липидов в пробе, к 1мл исследуемойкрови, и к 1 мл исследуемой пробы, по формулам:61Е / мл _ крови Е  объем_ фазыобъем_ крови _ в _ пробеДля гептановой фазы Е / мл _ крови Е 4 Е 8 ;0,5Для изопропаноловой фазы Е / мл _ крови Е 6 Е 12 .0,5Результаты выражали в единицах абсолютных значений Е 220, Е232, Е278, Е400 на млсубстрата(у.е./мл)Е232/Е220 (относительноеЕ278/Е220 (уровеньивединицахсодержаниекетодиеновииндексовдиеновыхсопряженныхокисленияконьюгатовтриенов–КД(е.и.о.):–ДК),иСТ) иЕ400/Е220 (уровень оснований Шиффа – ШО).Определение активности супероксиддисмутазы (СОД) в сыворотке кровикрыс по С.

Характеристики

Список файлов диссертации