Автореферат (1140768), страница 3
Текст из файла (страница 3)
В случае с ДМТАС создавался дефект уретры длиной 1,8см, которыйзамещался тубуляризированной матрицей. Проксимальный и дистальный анастомозы междукультями уретры и концами трубчатой ДМТАС формировали путем наложения узловыхшвов из монофиламентного нерассасывающегося шовного материала пролен 5-0.Рисунок 4 – Фотографии дорсальной уретропластики с применением децеллюризированнойартериальной стенкиПроизведена полная мобилизация луковичной и проксимальной части пенильнойуретры кролика на протяжении 2,2–2,5 см (рис.
4, а). Фрагмент уретры протяженностью1,8 см иссечен полностью (рис. 4, б). В ходе операции использовали окуляры операционные сувеличением 4,0×. Сформированный дефект уретры замещали трубчатой ДМТАС (рис. 4,в). Проксимальный и дистальный анастомозы между культями уретры и концамитрубчатой ДМТАС формировали путем наложения узловых швов из монофиламентногонерассасывающегося шовного материала пролен 5-0. (рис. 4, г).При проведении уретропластики с использованием гибридной матрицы, проводиласьдорсальная уретропластика. Матрица фиксировалась к вентральной поверхности белочнойоболочки пещеристых тел одиночными узловыми швами викрил 5-0 по краям и в центре.10Края матрицы сшивали с краями уретры в зоне дефекта непрерывным швом, используявикрил 5-0.Рисунок 5 – Фотографии дорсальной уретропластики с применением гибридной матрицы наоснове викриловой сетки и реконструированного коллагенаПроводили полную мобилизацию луковичной и проксимальной части пенильной уретрыкролика на протяжении 2,2–2,5 см (рис.
5, а). Полностью иссекали фрагмент уретры по еёдорсальной поверхности, размерами2.0х0.5 см (рис. 5, б). Матрица фиксировалась квентральной поверхности белочной оболочки пещеристых тел одиночными узловыми швамивикрил 5-0 по краям и в центре (рис. 5, в). Сформированный дефект уретры замещалиобразцом гибридной матрицы, размеры которой, после адаптации под уретральное ложесоставляли 2,0 х 0,5 см. Края матрицы сшивали с краями уретры в зоне дефектанепрерывным швом, используя викрил 5-0. (рис.
5, г).Оценку цитотоксичности проводили по оптимизированному методу Мосмана иМонкса (МТТ-тест) на 6-е сутки культивирования с применением линий клеток 3T3 и C3H ис использованием методов световой микроскопии и спекторофотометрии. Оценку адгезии ипролиферации клеток на матрицах проводили с использованием тех же линейныхфибробластов 3Т3 и С3Н и с той же плотностью посева как при оценке цитотоксичности.Для визуализации клеток применяли двойную окраску.11Световую микроскопию проводили на микроскопе Nikon TE-2000 при увеличениях×40, ×60, ×100, ×200, ×400 с фазовым контрастом для оценки контрольных лунок ивизуализации клеток, находящихся по краю матрицы.
Локализацию флуоресценции образцовматрикса фиксировали с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопаLSM-710 (Carl Zeiss Microscopy, Germany).Для морфологического исследования образцы тканей фиксировали не менее 48 ч в10% растворе нейтрального забуференного формалина (Biovitrum, Россия), проводили черезсерию спиртов восходящей концентрации, заливали в парафин. Микротомные срезытолщиной 5-6 мкм тщательно депарафинировали и окрашивали гематоксилином и эозином,пикрофуксином по Ван-Гизону (для выявления коллагена), фукселином по Унна (длявыявленияэластическихволокон),толуидиновымсиним(длявыявлениякислыхгликозаминогликанов).Изучение гистологических препаратов выполняли с помощью прямого световогомикроскопа исследовательского класса Olympus BX51 (Olympus, Japan), оснащенногоцветной цифровой камерой SDU-252 («Спецтелетехника», Россия) при оптическихувеличениях от 40× до 1000×.
Для оценки биосовместимости имплантированных гибридныхматриц изучали признаки периимплантационного воспаления (отек, экссудацию, клеточнуюинфильтрацию, нарушения микроциркуляции), а также проявления репаративной реакции(ангиогенез, пролиферацию фибробластов, распространенность и зрелость грануляционнойткани, характер и скорость интеграции имплантированных матриц с резидентными тканями),а также скорость биодеградации (резорбции матриц). Морфометрию тканевых элементовпроводили с использованием специализированного модуля стандартного пакета программAdobe Photoshop CS3 по микрофотографиям препаратов с помощью предварительноопределенных геометрических калибровочных коэффициентов, описывающих соответствиечисла пикселей изображения длине отрезка в микрометрах, для каждого используемогообъектива.Результаты исследования и их обсуждениеМакроскопически сразу после децеллюляризациистенкаартерии выгляделаразрыхленной. При микроскопическом исследовании ДМТАС выявлены коллагеновыеволокна, которые окрашиваются фуксинофильно, что свидетельствует о сохранностимолекулярной и супрамолекулярной структуры коллагена.
В целом матрица представляламестами разрыхленный, местами плотный коллагеновый каркас стенки артерии. Клетки вартериальной стенке отсутствовали, а из структур эластической сети частично сохранялисьлишь внутренняя и наружная эластические мембраны (черная стрелка) артерии и отдельные12слабоокрашенные эластические волокна средней оболочки. Таким образом, матрицапредставляет собой бесклеточный коллаген-эластиновый каркас сосудистой стенки.Втожевремяматрицанаосновесеткиизполилактогликолидаиреконструированного коллагена выглядит плотной, хорошо держит форму, оставаясь приэтом достаточно гибкой, не теряет пространственную структуру при длительном нахождениив воде. Имеет трехслойную структуру.
Таким образом,гибридная матрица обладаетхорошими механическими свойствами является сравнительно плотной, оставаясь при этомгибкой, она хорошо держит форму, меняя свою пространственную конфигурацию.Как уже было сказано выше, крысы с имплантированными матрицами выведены изэксперимента на 7 (ДМТАС) и 10 (гибридная матрица), 30, 60 и 90 сутки. Все участкиимплантации обеих матриц были без макроскопических изменений.
На 7-е сутки послеимплантации в ДМТАС усиливалось разрыхление коллагеновых пучков вследствие отекаткани,накраяхвыявлялисьмелкиеочагивоспалительнойинфильтрации.Соединительнотканная капсула вокруг ДМТАС к этому сроку еще не сформировывалась, нов окружающей ткани отмечалась слабая лимфомакрофагальная реакция с небольшойпримесью нейтрофильных лейкоцитов.Рисунок 6 – Микропрепарат матрицы ДМТАС (крысы)а — 7-е сутки после имплантации ДМТАС. Разрыхление коллагеновых пучков и очагивоспалительной инфильтрации. Комбинированная окраска по Ван-Гизону — Унна.
× 200; б— 30-е сутки после имплантации. Матрица (1), окруженная соединительнотканнойкапсулой (2), между ними располагается зона деструкции матрицы макрофагами (3); в —60-е сутки после имплантации. Большая часть матрикса (толстые стрелки) резорбированаи замещена грануляционной тканью (тонкие стрелки). Окраска гематоксилином и эозином.13× 200; г — полное отсутствие матрицы через 90 сут после имплантации.Нерассасывающиеся швы над областью фиксации матриц. Макроснимок.На 10-е сутки после имплантации гибридной матрицы определяется замещениеколлагеновой губки грануляционной тканью и прорастание ее через поры викриловой сетки,окраскагематоксилин-эозином.соединительнотканныхкапсулНавокруг30-есуткиДМТАС,отмечалосьпоявлялисьформированиепризнакичастичнойбиодеградации наружных слоев имплантата, что выражалось в макрофагальной резорбциинаружныхслоевимплантата(бывшейадвентициальнойоболочкисосуда).Микроскопическая картина после имплантации гибридной матрицы существенно отличаласьот таковой при оценке биодеграции ДМТАС: отмечается прорастание соединительной тканимежду филаментаминитей полилактогликолида, начинающаяся резорбция последних,отсутствует образование какой-либо капсулы.
К 60-м суткам продолжалась постепеннаядеструкцияДМТАС.Приэтомоставалсялишьтонкийфрагментимплантата,инфильтрированного макрофагами и лимфоцитами, тогда как большая часть имплантата кэтому времени была резорбирована. В то же время после имплантации гибридной матрицыотмечается лишь фиброзирование грануляционной ткани, частичный лизис викриловыхнитей, много гигантских клеток. На 90-е сутки почти во всех случаях наблюдалась полнаярезорбция имплантатов. Сходная картина определяется и при оценке гибридной матрицы:инволюция фиброзной ткани, пустые ячейки после лизиса полилактогликолида, лимфомакрофагальная инфильтрация.Рисунок 7 – 30 сутки после уретропластики (снимок слева)Определяется эпителий, расположенный на рыхлой соединительной ткани, богатойсосудами, с очагами инфильтрации лимфоцитами и макрофагами и близкий по структуре кслизистой оболочке уретры.
Окраска гематоксилин-эозином. х400. 60-е сутки послеимплантации. (снимок справа). Окраска гематоксилин-эозином. х400. Эпителий болеезрелый имеет типичную для уротелия многорядную структуру14При исследовании биодеградации и биосовместимости получены данные, чтоматрица резорбирует в близкие с матрицей на основе децеллюризированной артериальнойстенкисроки. Однако, имеются определенные особенности биодеградации гибриднойматрицы. В частности, резорбцияколлагена и PLGA происходит на всем протяженииматрицы, без четкого воспалительного вала, и более того, резорбирующие природный иискусственный полимеры макрофаги клетки определяются и в толще самой матрицы.Вдобавок к диффузному характеру резорбции определяется нежная грануляционная ткань сврастающими в матрицу новыми сосудами (т.е. неоангиогенез происходит в толще самойматрицы).Ретроградную уретроцистографию выполняли после удаления уретрального катетераспустя 1, 3 и 6 мес после операции (Рисунок 7).
Полученные уретрограммы сравнивали спредоперационной уретрограммой. На уретрограммах через 1 мес (а) после операции хорошовидна зона имплантации ДМТАС, затеков контрастного вещества не было (чтосвидетельствует о полном приживлении матрицы), просвет уретры полностью сохранен.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
