Диссертация (1139676), страница 48

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 48)

Преимуществаспособазаключаютсявбыстромикачественномопределениитипапротивомикробного действия биологически активных соединений, использованиенебольшого количества питательной среды при достаточно коротком временноминтервале, составляющем 24 ч.Новизна способа состоит в разработке опытным путем формулы расчета иопределении показателей коэффициента оптической плотности культуральнойсреды, соотносящиеся с бактериостатическим типом действия и бактерициднымтипом действия исследуемых соединений.Способ определения типа противомикробного действия новых соединений,обладающих антимикробной активностью, включает проведение исследованияоптической плотности культуральной жидкости в объеме 1 мл в стерильныхкюветах при длине волны 600 нм, далее зависимость оптической плотностинового соединения со штаммом бактерий Staphylococcus aureus 6538-P обнуляетсяпо показателям оптической плотности исследуемого соединения.

Определяетсяоптическая плотность культуральной среды в присутствии штамма бактерийStaphylococcus aureus 6538-P, культивируемого при МПК в объеме 1 мл и придвух-, четырех- и шестикратном увеличении МПК исследуемого соединения.Определяется оптическая плотность культуральной среды с исследуемыммикроорганизмом при культивировании без исследуемого соединения. На основеполученных показателей вычисляется коэффициент оптической плотностикультуральной среды по формуле (1):KD =D1 + D2 + D3 …+ Dnn×100,(1)350где КD – коэффициент оптической плотности культуральной среды,D – оптическая плотность культуральной жидкости при культивированиимикроорганизмов в присутствии различных концентраций противомикробногосоединения,n – количество исследованных концентраций соединения.Показатель КD с исследуемым соединением более 1 свидетельствует, чтоисследуемое соединение обладает бактериостатическим типом действия вотношении исследуемого микроорганизма, если менее 1 – исследуемоесоединение обладает бактерицидным типом действия в отношении исследуемогомикроорганизма.Дляпрепаратовсравнениясдоказаннымбактерициднымибактериостатическим действием был рассчитан показатель КD.Показатель КD с ампициллином оказался менее 1 (формула 2), этосвидетельствует о том, что противомикробный препарат обладает бактерициднымтипом действия в отношении Staphylococcus aureus 6538-P АТСС.KD =0,003 + 0,0029 + 0,003 + 0,0028×100 = 0,2934(2)Показатель КD с азитромицином более 1 (формула 3), следовательно,противомикробный препарат обладает бактериостатическим типом действия вотношении Staphylococcus aureus 6538-P АТСС.KD =0,018 + 0,014 + 0,010 + 0,007×100 = 1,234(3)Показатель КD с исследуемыми соединениями составлял более 1.Например, показатель КD с циклическим амидом HD в отношенииStaphylococcus aureus 6538-P АТСС (формула 4).KD =0,030 + 0,019 + 0,011 + 0,005×100 = 1,6254(4)351Показатель КD с амидом 7D в отношении Staphylococcus aureus 6538-PАТСС (формула 5).KD =0,060 + 0,030 + 0,012 + 0,004×100 = 2,654(5)Это свидетельствует о том, что исследуемые соединения, синтезированныена основе замещенных 4-, 5-, 6-, 7-аминоиндолов обладают бактериостатическимтипом противомикробного действия в отношении исследуемых микроорганизмов.С помощью нового способа определения типа противомикробного действияподтверждено бактериостатическое действие исследуемых соединений, изученноес помощью классической методики при воздействии исследуемых соединений вфизиологическом растворе при комнатной температуре и коротких экспозициях.Изучена цитотоксичность препаратов c лабораторными шифрами 5D, НD,S3 и 7D in vitro на линии опухолевых клеток HeLa (ATCC ® CCL-2TM).

МТТ-тестпоказал, что изучаемые соединения в исследуемом интервале концентраций (501000 мкг/мл) не обладают способностью оказывать токсическое воздействие наэукариотические клетки аденокарциномы шейки матки человека.При исследовании соединений 7D, 5D, S3 и HD в тесте Эймса установлено,что ни одно из соединений не вызывает превышение числа колоний,индуцированныхHis+-ревертантов,надспонтаннымфономмутирования(негативный контроль) более, чем в 2-2,5 раза, что свидетельствует об отсутствиимутагеннойактивностиданныхсоединенийвисследованномдиапазонеконцентраций и исключает токсическое воздействие на прокариотические клетки.Действие большинства современных синтетических противомикробныхпрепаратов связано либо с подавление синтеза ДНК, либо с подавлениембактериального белкового синтеза на уровне трансляции или транскрипции.Изучение влияния новых соединений на структуру дезоксирибонуклеиновыхкислот на примере бактериальной ДНК имеет большое значение не только дляопределениямолекулярныхмеханизмовантибактериальнойактивностисоединений, но и для прогноза его возможной генотоксичности.

Для выявления352ДНК-повреждающего действия соединений мы использовали тест-систему, вкоторой индукцию SOS оперонов в присутствии различных концентрацийиспытуемого вещества оценивали по абсолютному значению активности βгалактозидазы культуры тестерного штамма E.coli PQ37.Исходя из доказанного бактериостатического типа действия в МПКисследуемых соединений, можно предположить, что воздействие на клеточнуюстенку и цитоплазматическую мембрану микроорганизмов, что имеет следствиемгибель микробной клетки, не является механизмом противомикробного действиягруппы изучаемых производных 4-, 5-, 6-, 7-аминоиндолов. Исследуемыесоединения7D,5D,S3иHDдемонстрировалидозозависимыйSOS-индуцирующий эффект.

Ранее показано, что при исследовании выше указанныхсоединений в тесте Эймса установлено, что ни одно из изученных соединений необладает в данном диапазоне концентраций (от 10 до 1000 мкг/мл) ни прямымтоксическим действием, ни мутагенной активностью по отношению к тестерномуштамму S.typhimurium ТА 100.Таким образом, механизм действия исследуемых соединений включаетвоздействие на ДНК микробной клетки. В бактерицидных концентрацияхсоединения производные замещенных 4-, 6-, 7-аминоиндолов способны оказыватьДНК-повреждающеедействие,вбактериостатическихконцентрациях,вышеуказанные соединения, возможно, имеют дополнительный механизм, несопровождающийся образованием разрывов ДНК.Исследования на модели экспериментальной хирургической раневойинфекции in vivo были проведены для оценки эффективности местногоприменения исследуемых соединений, с лабораторными шифрами 5D, 7D, S3 иHD, против экспериментальной раневой инфекции у мышей, вызванной прямойинокуляцией S.aureus и соединений, с лабораторными шифрами S3 и HD, противэкспериментальной раневой инфекции у мышей, вызванной прямой инокуляциейP.aeruginosa,вповерхностныехирургическиераны.Исследуемыемикроорганизмы наиболее часто являются возбудителями раневых инфекций учеловека.

На этой модели исследуемые штаммы S.aureus и P.aeruginosa хорошо353размножались в тканях кожи экспериментальных мышей и сохранялись вбольшом количестве в ранах в отсутствие эффективной терапии (таблицы 5, 6).Таблица 5 – Динамика показателей среднего микробного числа в ранах,инфицированных S.aureus, на фоне лечения исследуемыми соединениями(метод поверхностных смывов)Деньпослеинфицирования1Среднее значение микробного числа в смывах с ран, Log КОЕ/рана(±m)*Контроль Диоксидин Циклический Амид S3 Циклический Циклическийамид 5 Dамид 7Dамид HD7,15±1,4-----27,68±1,56,66±1,65,37±0,76,19±1,36,85±0,85,99±1,337,92±2,15,98±0,74,94±1,65,98±2,06,03±2,25,82±0,947,89±3,05,87±1,34,52±1,65,75±0,95,83±1,45,38±2,157,86±2,04,85±0,54,26±2,14,93±1,55,32±2,44,94±1,567,82±1,04,41±2,13,74±0,84,54±0,54,93±0,94,21±1,377,75±1,43,79±1,32,87±0,53,75±1,33,88±0,53,86±2,1105,43±0,4-----142,93±2,4-----* – среднее отклонение.Местноелечениеисследуемымисоединениями,раствореннымивглицерине, приводило к сокращению числа жизнеспособных микроорганизмов вранах значительно раньше, чем можно было бы ожидать при естественномзаживлении необработанных ран, что приводило к элиминации бактерий изинфицированной ткани (рисунки 4, 5).354S.aureus АТСС 43300Количество микроорганизмов, КОЕ/рана10880710706106051050410403103021020110100 01 день2 день3 день4 день5 день6 день7DS37 деньДень после инфицированияКонтрольДиоксидин5DHDРисунок 4 – Количественные показатели микроорганизмов винфицированных ранах в процессе формирования экспериментальныххирургических ран, инфицированных S.aureus (метод поверхностныхсмывов)Таблица 6 – Динамика показателей среднего микробного числа в ранах,инфицированных P.aeruginosa, на фоне лечения исследуемыми соединениями(метод поверхностных смывов)ДеньСреднее значение микробного числа в смывах с ран, Logпослеинфици-КОЕ/рана(±m)*КонтрольДиоксидинАмид S3рованияЦиклическийамид HD1234516,4±1,4---26,94±1,55,9±1,35,92±2,25,99±1,33551234535,91±2,15,35±1,35,76±1,25,82±0,945,78±3,04,97±2,14,98±0,65,38±2,155,76±2,04,69±1,34,86±1,14,94±1,565,81±1,04,27±1,54,57±0,74,78±0,775,88±1,43,81±0,73,91±2,33,86±2,1104,21±2,5---143,82±1,0---* – среднее отклонение.Исследуемые соединения эффективно препятствовали распространениюмикроорганизмов в подлежащие ткани и генерализации инфекционного процесса.Количество микроорганизмов, КОЕ/ранаP.aeruginosa АТСС 2785310770106601055010440103301022010110001 день2 день3 день4 день5 день6 деньS3HD7 деньДень после инфицированияКонтрольДиоксидинРисунок 5 – Количественные показатели микроорганизмов винфицированных ранах в процессе формирования экспериментальныххирургических ран, инфицированных P.aeruginosa (метод поверхностныхсмывов)356Исследуемые соединения были столь же эффективны в устранении S.aureusи P.aeruginosa и ускоряли заживление зараженных ран, как и препарат сравнениядиоксидин, хорошо зарекомендовавший себя, как средство для местного лечениякожных инфекций.Эффективность исследуемых соединений в отношении экспериментальныхмикробных хирургических раневых инфекций, продемонстрированная в этомисследовании свидетельствует о противомикробной активности при местномприменении.В целом, антибактериальные свойства исследуемых индолиламидов in vitroи in vivo поддерживают использование этих новых противомикробныхсоединений в качестве местных антибактериальных агентов.357ИТОГИ ВЫПОЛНЕНИЯ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫНастоящее исследование было посвящено разработке и получению новогокласса синтетических лекарственных средств, на основе замещенных 4-, 5-, 6-, 7аминоиндолов,способныхпрокариотическиебезопасногооказыватьмикроорганизмы ииспользованияиндолиламидовипротивомикробноенанаучно-практическому обоснованиювыявленнойпирролохинолоновдействиепротивомикробнойдляповышенияактивностиэффективностипротивомикробной химиотерапии.На химико-технологическом этапе исследования были разработаны методыполучения и синтезированы 16 аминоиндолов и 32 производных аминоиндолов –индоламинов, енаминов и пиррохинолонов.С помощью компьютерной системы прогнозирования биологическойактивности веществ PASS (Prediction of Activity Spectra for Substances) на основеанализа, так называемых обучающих выборок, содержащих десятки тысячмолекул органических веществ различных химических классов, проявляющихмножество видов биологической активности произведен отбор 19 потенциальноактивных соединений.Выявлено, что отобранная серия индолиламидов и пирролохинолонов наосновезамещенных4-,5-,6-,7-аминоиндоловспособнаоказыватьпротивомикробной действие на тест-штаммы изученных условно-патогенных инекоторых патогенных прокариотическихмикроорганизмов и опытные штаммыусловно-патогенных и некоторых патогенных микроорганизмов, представителейсемействMicrococcaceae,Streptococcaceae,Bacillaceae,Enterobacteriaceae,Moraxellaceae, Pseudomonadaceae, Sphingomonadaceae, Xanthomonadaceae, чтопозволяет характеризовать ее как группу новых абиотических химическихфакторов.Для выделения из представленного ряда производных замещенных 4-, 5-, 6-,7-аминоиндолов наиболее перспективных молекул мы остановились на двухключевыхпараметрах:противомикробнаяэффективностьвотношении358грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, а также остраятоксичность при внутрибрюшинном, внутрижелудочном введении и накожномнанесении.

Характеристики

Список файлов диссертации