Автореферат (1139570), страница 4
Текст из файла (страница 4)
В журналах из перечня рецензируемых научных изданий ВАК опубликовано17 работ, из них 13 оригинальные статьи и 4 обзора литературы. В журналах реферируемыхРИНЦ опубликовано 15 работ (11 оригинальные статьи и четыре обзора литературы). В журналахреферируемых базой данных Scopus и/или Web of Science 14 работ (12 оригинальных статей и дваобзора литературы).Объем и структура диссертацииДиссертация изложена на 233 страницах машинописного текста и состоит из введения,основной части (обзора литературы, описания материалов и методов исследования и 7 глав,отражающих результаты собственных исследований), заключения, выводов, практическихрекомендаций, описания перспектив дальнейшей разработки темы, списка сокращений иусловных обозначений, списка литературы.
Диссертация иллюстрирована 40 таблицами и 12рисунками. Библиографический указатель включает 391 источник литературы, в том числе 91ссылка на отечественных авторов и 300 ссылок на зарубежных авторов.ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ1. Материалы и методы исследованияВсе образцы крови и ликвора инокулированные во флаконы для гемокультивирования,инкубировали в анализаторе гемокультур BACTEC 9050 (Becton Dickinson, США) до моментарегистрации микробного роста.
В качестве методов идентификации изолятов применялимикроскопическое исследование, посев на селективные и хромогенные питательные среды,иммунохимические и биохимические методы, включая использование автоматическогобактериологического анализатора Vitek 2 (BioMerieux, Франция).Посевы биологического материала производили на питательные среды: кровяной агар иUri-select агар (BioRad, США), затем инкубировали в термостате при температуре 37°С в течение24 - 48 ч. Видовую идентификацию проводили на масс-спектрометре MALDI-TOF-MS (BrukerDaltonics, Германия) и в баканализаторе Vitek 2.Для определения чувствительности к антимикробным препаратам (АМП) использовалитри метода: диско-диффузионный (диски Bio-Rad, США), метод Е-тестов (BioMerieux, Франция)на среде Мюллера-Хинтона (Biorad, США) и автоматизированный метод на баканализатореVITEK 2 Compact (BioMerieux, Франция).
Метод Е-тестов использовали для определения МПК15имипенема,меропенема итигециклина. Результаты интерпретировали, руководствуясьоценочными критериями установленными Клиническими рекомендациями «Определениечувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам» и Европейским комитетом поопределению чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам (EuropeanCommittee on Antimicrobial Susceptibility Testing, EUCAST). В качестве контрольных штаммовиспользовали E.
coli ATCC 25922, E. coli ATCC 35218, P. aeruginosa ATCC 27653, A. baumanniiATCC 19606. В отношении устойчивости к карбапенемам штаммы делили на 2 группы:карбапенемчувствительные (карба-Ч) и карбапенемрезистентные (карба-Р).Бактериальную ДНК выделяли с помощью коммерческих наборов «ГК-экспресс»(ЦНИИЭ Роспотребнадзора) согласно инструкции производителя. Для выявления генов БЛРС икарбапенемаз использовали метод ПЦР. Для выявления генов БЛРС blaCTX-M и blaТЕМ былииспользованы праймеры, предложенные Edelstein M., 2003. Компоненты реакционной смесисмешивали непосредственно перед проведением эксперимента.
Результаты реакции оценивалипутем проведения горизонтального электрофореза в 2% агарозном геле.Выявление генов, кодирующих продукцию карбапенемаз, проводили с использованиемнаборов с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «АмплиСенс® MDR MBL-FL» (IMP,NDM, VIM), «АмплиСенс® MDR KPC/OXA-48-FL» (KPC, OXA-48), «АмплиСенс MDR AbOXA-FL» (OXA-23, OXA-40, OXA-58), производства ЦНИИЭ Роспотребнадзора.
Компонентыреакционной смеси смешивали непосредственно перед проведением амплификации. В качествеположительного и отрицательного контролей использовали соответствующие образцы, входящиев состав набора. Результаты оценивали согласно инструкции производителя.Для генотипирования штаммов A. baumannii, P. аeruginosa, K. pneumoniae использовалиметод МЛСТ.
Использовали ДНК, экстрагированную из чистых культур. Подготовка матриц длясеквенирования включала амплификацию внутренних фрагментов генов «домашнего хозяйства».Очистку ПЦР-продуктов от избытка праймеров, димеров праймеров и дНТФ проводилиферментативным разрушением с помощью экзонуклеазы I и щелочной фосфатазы (SAP,Affymetrix, США) при 370С в течение 30 мин. с последующей инактивацией при 850 С.Секвенирование проводили с использованием наборов реагентов и оборудования фирмы AppliedBiosystems (США) по методике, описанной производителем.
Полученные в результатесеквенирования нуклеотидные последовательности генов «домашнего хозяйства» обрабатывали спомощью программы SeqMan, затем сравнивали с базой аллелей, используя специализированнуюпрограмму для обработки результатов типирования, исследуемой аллели присваивалсясоответствующий номер.Пневмококки выделяли из посева биоматериала носоглотки на колумбийском кровяномагаре с добавлением 3% лошадиной сыворотки. Идентификацию проводили на основании16морфологических и культуральных свойств, а также с помощью теста с оптохином и реакциилатекс-агглютинации (Slidex Pneumo-Kit, BioMerieux, Франция). Капсульный тип определялипутем серологического типирования в реакции латексной агглютинации и/или реакции набуханиякапсулы по Нейфельду с использованием сывороток Statens Serum Institut (Дания), а также спомощью молекулярного типирования методом мультиплексной ПЦР с последующимсерологическим типированием редких серотипов (Алябьева Н.М. и соавт., 2013).
Нетипируемымисчитали пневмококки, которые не агглютинировались ни одной из пуловых сывороток (пулы A-Iи P-T). Чувствительность пневмококков к оксациллину (ОХА), эритромицину (ERY),клиндамицину (CLI), триметоприму/сульфаметоксазолу (SXT), хлорамфениколу (CHL) итетрациклину (TET) определяли при помощи диско-диффузионного метода (диски Bio-Rad,США). OXA-, ERY- и CLI-резистентные пневмококки дополнительно исследовали сиспользованием Е-тестов (BioMerieux, Франция). Наличие индуцибельной устойчивости к CLI уERY-резистентных/CLI-чувствительных пневмококков регистрировали в случае уплощения зоныподавления роста (D-феномен) вокруг диска с CLI, расположенного рядом с ERY-диском(расстояние между краями дисков 12-16 мм). Детекцию генов резистентности ermB и mef у ERYрезистентных пневмококков проводили при помощи ПЦР описанными ранее методами (АлябьеваН.М., 2014).Для посева S.
pyogenes использовали 5% кровяной агар. Идентификацию проводилиобщепринятыми в микробиологии методами, используя диски с бацитрацином, реакцию латексагглютинации(Slidexstrepto-kit,bioMerieuх)инаанализатореMALDI-TOFMS.Чувствительность к ERY и CLI определяли диско-диффузионным методом (диски BioRad) насреде Мюллера-Хинтона с добавлением 5% крови. У ERY-резистентных изолятов S.
pyogenes,выделенных в 2014 - 2016 гг, МПК ERY и CLI определяли с помощью Е-теста, (bioMerieux,Франция). Интерпретацию результатов чувствительности штаммов S. pyogenes к антибиотикампроводили по критериям, указанным выше. Результаты чувствительности S. pyogenes казитромицину и кларитромицину, полученные диско-диффузионным методом, интерпретировалипо МУК 4.2. 1890-04 в связи с отсутствием соответствующих критериев в стандартах EUCAST.Результаты определения чувствительности к спирамицину диско-диффузионным методомтрактовались согласно стандартам комитета по антибиотикограммам Французского обществамикробиологов (CASFM-2012).
К категории «нечувствительный» мы относили изоляты,обладавшие умеренным и высоким уровнем резистентности.Статистический анализ проводили с применением пакета IBM SPSS Statistics for Windows,версия 20.0 (IBM Corp.). Для анализа таблиц сопряженности при сравнении долей использовалиχ2 или z-критерий, где это необходимо. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.172. Госпитальные грамотрицательные бактерииСостав микробиоты, выделенной из трахеального аспирата включал 235 изолятов на 136проб. С наибольшей частотой от пациентов, находящихся на ИВЛ, выделялись: K. pneumoniae(24,6%), A. baumannii (23,8%), P. aeruginosa (11,9), Ralstonia picketii (7,7%) и Staphylococcus aureus(7,2%).
Долевое участие в микробиоте трахеального аспирата E. faecium и E. coli составило 3,8%и 4,2% соответственно. На остальные виды микроорганизмов, выделенных из трахеальногоаспирата с частотой от 0,5% до 2,5%, пришлось 14,8%.Анализ динамики колонизации слизистых респираторного тракта при исследованиитрахеального аспирата проведенного по трем периодам пребывания в ОРИТ, показал, что припоступлении в ОРИТ (I период) в совокупности было выделено всего 37 изолятов, включавшихK. pneumoniae (27%), A. baumannii (29,7%), S. aureus (18,9%) и E. coli (13,5%).Во II периоде (3-5 сутки пребывания в ОРИТ) в микробный спектр трахеального аспиратадобавились и другие представители внутрибольничной микробиоты, такие как R.
picketii (10,5%)и P. aeruginosa (9,2%). В этот же период уменьшилась в 2 раза (до 9,2%) частота выделения S.aureus.В III периоде (>5 суток) практически исчез S. aureus (до 2,4%, p<0,001), но увеличилосьдолевое участие в микробиоте P. aeruginosa (до 16,4%, p<0,05). В то же время K. pneumoniae(28,7%) и A. baumannii (22,1%) и в этот период сохранили свое доминирующее положение внутримикробиоты трахеального аспирата.Мониторинг антибиотикорезистентности проводился у представителей ведущей группыпатогенов, учитывая высокую частоту их циркуляции в ОРИТ. Результаты определениярезистентности к антибиотикам у выделенных штаммов грамотрицательной флоры (Таблица 1)выявили, что среди изолятов K. рneumoniae, A.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
