В.Л. Быков - Цитология и общая гистология (1135296), страница 4
Текст из файла (страница 4)
тем самым маркируя эти клетки. - 20 Культивирование (зкспяантация) клеток, тканей и органов (или их фрагментов) в условиях ш чйго производится для изучения влияния различных факторов на их рост, дифферепцировку, синтетические, сскреторные и др. пропессы. Совместное культивирование эксплантатов различных псаней или эмбриональных зачатков (ко-культивиоование) позволяет проанализировать их ипдупируюшее влияние друг па »руга. Культивирование осуществляется в спепиальных приборах в условиях тперияьности с использованием птпатеяьных сред и определен- ~и>го газового сос>пава. Для получения культуры клеток их предвари>сльно выделяют пз органов и тканей путем дозированной ферментпой л механической обработки.
Клетки в культуре могут находизъся во ааешенном состоянии (суспензионные культуры) или расти по твердо«у субстрату. Первичные кулыпуры клеток, непосредственно выделенных из различных органов, обычно гибнут в течение нескольких недель. ' 1олучены стандартпь>е перевиваемые (стабильные) линии генетически измененных (трансформированных) клеток (например, клеточная линия ! !е(,а), которые могут сохранятъся при пересеве в течение десятков лет и служить удобным объектом для пптологических, фармакологических, >оксикологических, микробиологических и др.
исследований. В последние годы клеточные и тканевые культуры стали использовать в целях диатехнологии и биоинженерии (получение клеточною или ткаиевого чатериала для трансплантации, синтез биологически активных вешеств, >родукпяя моноклональных антител и др). МЕТОДЫ МИКРОСКОПИРОВАНИЯ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ И ЦИТОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ Световая микроскопия Стандартная световая микроскопия осушествляется пугем изу~с>шя препарата в проходящем свете.
Свет в световом (светооптичсс- - 2) ком) микроскопе собирается в канденсаре и пропускается через препарат, изменяясь за счет различия свойств образующих его структур. Далее свет входит в абьектив. в фокальной плоскости которого формируется изображение.
Окуляр увеличивает зго изображение и направляет его в глаз (рис. 2-3). Главными характеристиками микроскопа служат его разрешающая способность и увеличение, Рис. 2-Э. Оптичвскяя сквмв светового микрпсжспэ Сает, иэлучвямый источником сввтв (ИС) - обычно электрической лампочкой - спбирэвтся линзами кпндвнсара (ЛК) н пропускается через иэучввмый препарат (ПРЕ), который рвспплвгввтся тном стпликв (ПРС). Далее сеет направляется в линзы объектива (ЛОБ), нв предметном и в фпквлънпй плоскости которого фярмирувтся изображение. Лрвлпмляяс р (при), лучи через тубус (т) проецируются в линзы окуляра (лок), который увеличивэвт сфпрмирпвэнноя изображение и направляет вгп в глаз.
Разрешающая способность (разрешение) микроскопа - минимальное расстояние между двумя точками объекта, которые видны в нем раздельно. Она обусловливается абьекгливам и зависит от длины световой волны (повьппаясь с ее укорочением) и от особой оптической характеристики объектива - числовой апертуры (увеличиваясь по мере ее нарастания). Теоретические разрешение светового микроскопа составляет 0.2 мки, практически оно обычно равно 0.4 мки.
Увеличение микроскопа оценивается соотношением мехе(у линейными размераии создаваемого им изображения изучаемого объекта и самого обьекта. Оно рассчитывается как произведение увеличений объектива и окуляра. Общее увеличение светооптического микроскопа равно 2000-2500, однако полезное увеличение (способствувлцее выявлению деталей объекта) составляет до 1500 раз. Специальные методы световой микроскопии Темнопольная микроскопия (микроскопия в темном поле) основана на использовании специального канденсарсй обеспечивающего освещение препарата косыми лучами, пе попадающими в объектив. В отсутствие объектов поле зрения представгистся темным.
При их наличии часть света отражается ими в объектив, в результате чего их изображение обнаруживается в окуляре. Метод позволяет выявить структуры, размеры которых лежат за пределами разрешения светового микроскопа. Ол может использоваться для изучения живых клеток. Фезова-контрастная микроскопия основана на неодинаковом изменении фазы световых лучей при их прохождении через различные структуры изучаемого объекта. Фазово-контрастный микроскоп преобразует незаметные для человеческого глаза фазевыг различия в амплитудные. Этот метод дает возможность непосредственного изучения живых клеток без их фиксации и окрашивания. Поляризационная микроскопия используется для изучения структур, обладаюпшх свойствами анизатрапии или двойнега лучепреломления. В поляризационном микроскопе на объект направляется тюляриюванный пучок света, который в далыюйшем пропускается через анатизатор (расположенньш между объективом и окуляром) - устройство, определяющее отклонения плоскости поняризации света вследствие его прохождения через объект.
Тем самым выявляется закономерное пространственное расположение молекул в объекте. Ультрафиолетовая микроскопия связана с освещением изучаемого объекта улылрафиолетавыми лучами. которые избирательно по~лощаются его структурными компонентами. Благодаря тому, что ультрафиолетовые лучи имеют более короткую длину волны по сравнению , лучами видимой части спектра, разрешающая способность микроскопа повьппается примерно вдвое.
Невидимое изображение в ультрафио~стовом микроскопе преобразуется в видимое.с помощью люминеспентного экрана или других устройств. Флюоресцентная (люмииесцеитиая) микроскопия использует способность некоторых веществ излучать видимый свет при освешении объекта ультрафиолетовьии лучами (аутофлюоресценция). В некоторых случаях (например, при вьивлении катехоламинов методом Фалька) фэпооресценшш возникает после предварительной химической обработки ткани. Прилсеняют также флюоресцентные красители (флюорохромый связываюшяеся с различными структурами нли веществами в клетках и межклеточнолэ вешестве. Так, акридиновьш оранжевый, связываясь с ДНК, даст свечение желто-зеленого цвета, а с РНК - красно-оранжевого.
Флкюресцентные красители связывают (коиыогируют) со специфическими антэггеламн для выявления соответствуялцих антлгенов в тканях иммуногистохиьшческими методамн (см. выше). КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА КЛЕТОЧНЫХ И ТКАНЕВЫХ СТРУКТУР Морфоиетрические методы Морфомвтричвские мвгподы представляют собой совокупность приемов, цозволяюших дать количественную оценку параметров клеточных и тканевых структур на гистологических или цнтологических препаратах (нли их Фотографиях).
Путем использования этих методов определяют такие параметры, как, например, диаметр, высоту, толщину, шюшадь сечения, количество обьекзов на единице площади, их форму и др. При морфометрии объектов на гисзологнческих препаратах необходимо учитывать, что оцениваемые параметры относятся ие к собственно ткапевым компоиеипшм, а к их сечениям на срезах. Морфомезические методы могут использоваться при изучении объектов не только под световым микроскопом, но и на злектронно-микроскопическом уровне (см.ниже).
Сэпереологические методы, в отличие от стандартных морфометрнческих, позволяют путем специальных приемов и расчетов определить истинные (трехмерные) параметры объектов (например, их относительньпй объем, содержание в единице объема и др.), исходя из опенки на срезах нх линейных и плоскостных параметров. Ручная морфометрня основана па проведении подсчетов визуально, непосредственно под микроскопом или па микрофкцографиях с использованием линеек, сеток (в том числе в виде окуэирных встзвок) н других приспособлений.
Методы полуавтоматического и автоматического анализа изображения с применением компьютеров получили широкое распространение благодаря своей высокой производительности. Они позволяют - 24- быстро количественно оценить большое число признаков на изучаемом препарате и по их совокупности идентнфипировать различныс структуры (например, типы клеток по распределению хроматина в нх ядрах). Приборные микроскопические методы длк количестаенной оценки гистохиыических и имыуногистохимических реакций Цитофотометрия - количественньш приборный метод, лающий возможность оценить содержание исследуемого вещества в структурных элементах тканей и клеток. Измерения производятся на специальном приборе - цшкофотометре - путем оценки оптической лхотпости экрагпенного продукта гистохимической реакции выявления изучаемо:о вещества в пределах определенной плошади препарата (зонда) при пине световой волны, соотаетстауюшей максимуму псалошенги использованного красителя.
При измерении содержания ДНК полученные юнные сопоставляют с результатами измерений в заведомо диплондных .четках (например, в покоюцихся лимфоцитах), что позволяет оцениють результаты в единицах плоидности. Проточная цитометрия, или фяоу-цитомвтрия (от англ. ()озч поток) - высокозффективньш приборный количественный метод олен.и содержания веществ в клетках, находящихся в суспензиях.
Подготовка клеток к анализу заключается в их окрашиванни с исашьзованием флвюресцнруюшнх красителей в питохимических или ~млгуноцитохимических реакциях (см. выше). В последнем случае краптели конъюгированы со специфическими антителамн. При работе тканями их предварительно обрабатывают ферментами для разруюния межклеточных связей и получения клеточных суспензий. Окраска клеток флюоресцируюсцими красителями используется ~я маркировки искомого вещества.
Некоторые вещества можно непо,юдственно выявить путем цятохимнческой реакции с избирательно ~язываюпшьсся с ними красителем (например, ДНК с помошью бромн- ~ зтидня). Для маркировки других вешеств клетки обрабатываю.г спе~фическими антэгтелами, с которьцги конъюгированы флюореспируюпе красители. При атом маркированные антитела связываются с соотгсзвуюшими клеточными антигенами (вешествами) в результате иммуьчитохимической реакции. Проточный цитометр (флоу-цитомеэпр) с высокой скоростью юпускает суспензию окрашенных клеток через узкую капиллярную : убку, освегценную лучом лазера. Уровеиь флюоресценцяи каждой ютки илн ее ядра (соответствуюший содержаншо исследуемого вешес- ко ~ — ~ Фэ - 2б- - 27- тва) последовательно регистрируется с помощью специальных детекторов со скоростью до нескольких десятков тысяч клеток в 1 мин.
с построением соответствуюпшх гистограмм (графиков распределения) содержания вещества. В некоторых случаях через капилляр пропускают неокрашенные клетки (форменные элементы крови) и оценивают распределение их размеров и формы, Клеточная сортировка позволяет выделить клетки с оиредсленпымн маркернмми признаками (илгг их сочетанием) из клеточной суспензии. Процедура реализуется с использованием специального прибора - сартера (клеточного анализатора), работаюшего по принпнпу проточного цитометра.
но с возможностью Чюрмирования мелких капель, содержащих отдельные клетки, которые, в зависимости от наличия маркировочного сшнала, сортируются и направляются в различные контейнеры. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ОГАНОВ, ТКАНЕЙ И КЛЕТОК ПОД ЭЛЕКТРОННЫМ МИКРОСКОПОМ В настоящее время в научных исследованиях и клинической диагностике широкое применение нашли два метода электронной микроскошш - трансмиссианная (просвечивающая) электронная микроскопия и сканирующая [рааправая) электронная микроскопия, использующие соответствующие микроскопы - ТЭМ (ПЭМ) и СЭМ (РЭМ). ТРАНСМИССИОННАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ Траисмиссиониая (просвечивающая) электронная микроскопиял основана на использовании пучка эяеюпранов, излучаемого электронной пугнкай внутри колпины микроскопа в условиях высокого ускорято)пего напряжения (40-100 кВ) и глубокого вакуума (10 4 мм рт.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
