В.Л. Быков - Цитология и общая гистология (1135296), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Глава 2 МЕТОДЫ ЦИТОЛОГИЧЕСКИХ И ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ Размеры объектов и их деталей. изучаемые с использованием цитолопэческих и гистологических методов, обычно столь малы. что невидимы невсюруженным глазом. Ови составляют премущественно микрометры (мкм) в световой микроскопии и нонометры (нм) в электронной микроскопии.
Широко исполыуемая ранее едииипа ангстрем (А), равная 10 нм, в настоящее время более не применяется. Соотношения между веяишнами линейных единиц измерения, наиболее часто используемых в гистологии и шпопогии: = 1О" А = 104 А =10 А = 10п нм нуз =10е м =10э м = 10|ам = 10з мкм = 10в нм ВУЗ „103 = 10 е мм 10 з мкм = 10 " мм = 10 4 мкм 1 миллиметр (1 мм) 1 микрометр (1 мкм) 1 нанометр (1 нм) 1 ангстрем (1 А) Гистология и цитология располагают разнообразным арсеналом как классических, так и современных мепюдов, направленных на изучение апроения и функций клеток, тканей и органов.
Цитолопгэеские и гистологические методы исследования получают все бопыпее распространение и в клинической диагностике различных заболеваний. В этой связи вопросы взятия, обработки и изучения материала для питологического и гистологического исследования. рассматриваемые ниже, имеют не только теоретическое, но и сугубо прикладное, кяиническое. значение. В последние годы особую роль в раскрытии закономерностей деятельности органов, тканей и клеток играют новые морфофункпиональные метоюя. испопьзуюпще достижения современной биохимии, физика, иммунологии и молекулярной биологии - цито- и гистохимические, иммуноцшпо- и гигтохимические, авторадиографические, метод гибридизации т гйи и др.
Использование методов электронной микроскопии позволяет с высоким разрешением выявить тонкие структурные детали на различных уровнях - от клеточного до макромолекулярного. Указанные современные методы из области научных исследований активно проникают в практическую клнническую диагностику. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ОГАНОВ, ТКАНЕЙ И КЛЕТОК ПОД СВЕТОВЫМ МИКРОСКОПОМ гистологические и цитологические методы исследовдния ~ Взятие материала длк гистологического исследовали(в производится путем биопсии (от греч. Ъкж — жизнь и орэа - зрение) - извлечения кусочка изучаемого органа (биоптата) из живого организма в целях прижизненной диагностики, Вноптат часто получают из внутренних органов при эндосхопии (от греч.
епдо - внутри, э)4ореосмотреть) - исследовании полых органов с помощью гибких трубчатых прнборов, снабженных освещением, оптическими системами и дополнительными приспособлениями (в часпюсти. дпя взятия цитолоп4ческого и гистологического материаяа). Материал дпя гистологического исследования в целях посмертной диагвостяки получают также при патологоанатомическом вскрытии - аутопсии (от греч.
ашоа - сам и орюэзрение, т.е. уэиденное собственньии глазами). В акспериментальных исследованвях получают ткани и органы лабораторных животных (целиком или в виде фрагментов). После взятая материала его подвергают специальной обработке для подготовки к последувпцему микроскопическому исследованшо. Подготовка материала к гистологическому исследоааииэо.
Основным методом в гистологических исследовашгях является изучение окрашенных срезов различных тканей и органов. Традиционный способ подгоювки материала для получения постоянного гистологического препарата включает: (1) фиксацию материала, (2) проводку (обезвоживание), (3) заливку (уплотнение), (4) приготовление гистологических срезов (резку), (5) окрашивание срезов, (6! заключение срезов. 1.
Фиксация гистологического материала (от лат. йхапо - закрепление) осуществляется для "закрепления" его прижизненною строения. Она препотврашает разложенне извлеченных из организма тканей под действием собственных ферментов (процесс аутояиэа - от греч. аппж - сал4 и 1увэ - распад), а также ферментов микроорганизмов и способствует сохранению целостности клеточных и тканевых структур. Воздействуя на ткани.
фиксатор (например, формалин, спирт, пнкрвновая кислота или различные сложные смеси веществ). вызывает необратимую коагуляпию белков и быструю гибель клеток. Наиболее часто используют иимерсионную фиксацию - погружение (иммерсию - от лат.
швпепйо - погружение) кусочка органа в распюр фиксатора; в экспериментальных условнях фиксатор нередко вводят через сосудистую систему (перфузионная фиксация - от лат. рег(пэ1о - вливание). - 13 Хотя исследования фиксированного материала проводятся не живых, а на мертвых тканях и клетках, при оптимальной фиксации о сохраняют морфолог)Р(вские особенности, свойственные живым объфтам.
Благодаря этому на основании анализа фиксированного материцла можно делать заключения о прижизненном строении клоп)к и тканрй. При фиксации материала, как и на всех дальнейших этапах его подготовки к исследованию. возможно появление аргвефакгпав. Арте(пакты (от лат. аг(е - искусство и (ас(цш - пролукт) - признаки, возникаввцне в структуре клеток и тканей в результате вмешатецьства исследователя на различных этапах обработки материала и отсутствующие в них прижизненно.
При анализе конкретного обьекта предпочтительно использование методов. лающих минимально выраженные артефакты. Типичным артефактом фиксации, в особенности. в спиртовых растворах, служит сжатие клеток и тканей. 3. Проводка (обезвоживание) материала осуществляется путем последовательного помещения кусочка в спирты возрастающих концентраций для удаления из него воды. Она необходнма для выполнения следующего этапа обрабслки материала - его заливки. 3.
Заливка (уплогпнвнив) .нагпвриала достигаема путем пропитьвыпьз обезвоженного кусочка загпвердеваюи(ими средами: расплавленным парафинам, целлаидинам или специальной пластической массой. В результате заливки после охлаждения парафина или полимеризации штастмассы кусочек ткани (блок) становится достаточно плотным для получения тонких срезов при резке. 4. Приготовление гисгпалогических срезов (резка) осуществляется на специальном приборе (микран1оме) с помощью особых стальных ножей - бритв (рнс. 2-1). При этом обычно получают срезы залитото в парафин или другую среду материала толщиной 5-7 мкм (в оптимальном варианте - свриг)ные, т.е.
следующие один за другим в виде непрерывной ленты). Резкг1 замороженного материала (затвердевшего при быстром охлаждении углекислотой или по)ружением в жидкий азот) позволяет получить тонкие срезы„минуя этап заливки. Она производится на эамаралгиваюи(гм микрагпаме (микротоме, снабжеш(ом заморажнваюпшм устройством) нли в криаспгагпе (сцециальном холодильном шкафу с помещенным в него микротомом). Благодаря своей скорости этот метод используется для экспресс-диагнасгпики (в частности, в ходе выполнения хирургических операций, котда дальнейший характер вмешатель- етва может определяться поставленным гистологическим диагнозом). Он ()риме1тяется также в тех случаях. когда фиксация тканеи нежелательна, н пример, при гисгпахимических и иммунагисглахимических исследован (см.
ниже). При проведении этих исследований важно, что нефикс ванньш материал, замороженный в жидком азоте. может храниться в ем неопределенно долго без изменения содержания, распределения и ~ктивности всех биологических веществ. Рис. 2-1. Приготовление постоянного гистологического препарата иэ кусочка ткани, залитого э эагвердеваюшую среду. Фиксированный и залитый в парафин, целлоидин или пластмассу кусочек ткани - блок (БЛ) - режут с помощью стальной бритвы (БР) на специальном приборе - микротоме (1). Для получения среза (СР) по оси А в различных конструкциях микротомов перемещается либо БР, либо БЛ, тогда как второй элемент остается неподвижным.
Толщина СР определяется величиной шага взаимного смещения БЛ и БР по оси В. СР в аиде серии (ССР) далее монтируют на предметное стекло (ПРС), гюдвергают депарафинированию (или удалению пластмассы) и окрашивают (2), далее СР обезвсживают, просветляют, заключают в прозрачную консервирующую среду (КС) - бальзам или синтетическую смолу- и закрывают сверху покрсеным стеклом (ПСС) - (3). В результате получают постоянный гистологический препарат (4). 5.
Окрашивание срезов обычно производится после их монтир»ь валил (приклеивания) на предметное стекло и удаления нз них парафина (депарафинирпванил). Окрашивапие позволяет выявить различи~»с структурные компоненты тканей и клеток благодаря их неодинаково)»у сродству к гистологическим крагителлм. Гистологические красители разделяются на две главные груп»»ь» основные и кислые. Основные красители (например, гематоксищш, толуидиновэп» и метиленовый синий.
азур 11) активно связываются со структурами, содсржапшми кислоты (например, ДНК и РНК) и несущими отрицательный заряд. Способность окрашиваться основными красителями называется базпфилией (от греч. Ьаэ»э - основание и р1пйа - любовь), а структуры„связывающие эти красители — базофильными. Базофилией в клетке обладает ядро (вследствие высокого содержания ДНК и РНК), а также пптоплазма - при высоком содержании в ней рнбосом или»ранулярпой (шероховатой) эцдоплазматичсской сети (грЭПС). Базофильно может окрашиваться межклеточное вещество некоторых тканей (»»ю»ример, хряп»евой). Метптромазил (от греч.
»пе»а - изменение и с)по»»за - краска) - изменение цвета отдельных основных красителей. (например, толувд»в»он»яо синего, азура 11 или тионина) при их связывании с некоторыми с»руктурами, обладающими специфическими химическими свойствами (обычно высокой концентрацией сульфатированных гликозаминогликапоих Способностью окрапшваться метл»гхрпматическ»» обладают»ранулы базофнльных лейкошпов и»учных клеток, а также основное вещество хряща. Указанные красители окрашивают другие базофильные струкзуры в тех же тканях в обычный свойственный вм цвет (пртохромшнически - от греч.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
