Ю.И. Афанасьев, А.Н. Яцковский - Лабораторные занятия по курсу гистологии, цитологии и эмбриологии (1135293), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Открытие волновых свойств, присущих электронам, послужило основой для создания нового класса приборов — электронных микроскопов. Максимальное разрешение, которое может быть получено в них при специальных условиях, составляет 0,2 нм, а увеличение может достигать !00— 200 тыс. раз. Принципы работы электронного микроскопа Принципиальная схема построения изображения в световом и электронном микроскопах сходна. Однако существует ряд отличий: в электронных микроскопах источником электронов служит катод, входящий в состав электронной пушки, в качестве линз используются электромагнитные катушки, В связи с тсм что в воздухе электроны могут проникать на незначительные расстояния, а затем их скоростагтаснет, в электронном микроскопе с помощью специальных насосов создастся высокий вакуум (!О 4 мм рт.
ст.). В колонне микроскопа (тубусе), из которой откачан воздух, последовательно расположены катод (вольфрамовая нить), анод (металлическая пластинка с отверстием посередине), магнитные линзы, люминесцентный экран, фотопластинки ("магазин"). '!'ок, проходя через вольфрамовую нить катода, нагревает ее и вызывает эмиссию электронов.
Поданное на катод высокое напряжение создает большую разность потенциалов между катодом и анодом, что обеспечивает движение электронов к аноду и далее вниз по колонне микроскопа. Электронный пучок сначала фокусируется первой магнитной линзой — конде нсо- рно. Ббльшая часть электронов, проходя через объект, не отклоняется. Электроны, прошедшие через объект, фокусируются второй магнитной линзой — о б ъ е к т и в н о й, которая дает увеличенное изображение объекта. Это изображение снова увеличивается третьей магнитной линзой — проекционной. При этом электроны, которые проходят через объект, вызывают свечение экрана, покрытого люминофором, а отклонившиеся электроны не доходят до экрана и не вызывают свечения.
Изображение, полученное на люминссцентном экране, можно сфотографировать, если поднять экран, под которым расположен фотомагазин с фотопластинками, чтобы пучок электронов попал на фотопластинку. Подготовка материала для электронно-микроскопического исследования Подготовка к электронно-микроскопическому исследованию включает в себя те же этапы, что н при светооптической микроскопии, но с рядом особенностей (см. рис.
2, Б). Взятие материала необходимо проводить как можно быстрее, небольшими объемами (не более 1 ммэ). Фи к с а ци ю осуществляк>т, как правило, глутаральдегидом, хорошо стабилизирующим белки, с последун>щей дофиксацией в тетраоксиде осмия, который стабилизирует фосфолипиды, на холоде в течение нескольких часвв. После фиксации материал промывак>т буферным раствором, обсзвоживают спиртами возрастающей концентрации. У п л о т н е н и е и з а л и в к у производят с помощью полимеризующейся смеси (эпоксидные смеси).
Для этого оГ>разцы материала кладут в формы, заливают эпоксидной смолой и помещают в термостат, где происходит полимернзация смолы. Для приготовления срезов (толщиной 30 — 50 нм) используют ультратомы, в которых подача блока с объектом на неподвижный нож осуществляется с помощью теплового расширения несущего стержня, В качсстве ножей применяют специально приготовленные сколы стекла или алмазов. Получаемые при этом последовательные серийные срезы сползают с ножа в виде лент на поверхность жидкости в прикрепленной к ножу ванночке, откуда их надо перенести на сеточки, Контрастирование (или окрашивание) с р е зов проводят с помощью солей тяжелых металлов (свинца, вольфрама, урана). Содержащиеся в этих соединениях элементы с высокой атомной массой осаждав>тся на фосфолипидах клеточных мембран и не пропускают электронный луч, вследствие чего эти участки клетки выглядят на экране более темными, контрастными по сравнению с другимн участками, не содержащими фосфолипидов.
Для ориентировки в изучаемом обьекте используют метод изготовления полутонких срезов (! — 2 мкм) с последующим окрашиванием (метнленовым синим или толуидиновым синим). Окрашенный срез рассматривают с помощью микроскопа для определения области, которая должна быть изучена на ультрамикроскопичсском уровне, н в дальнсйшем с этого участка прицельно готовят ультратонкие срезы. 7. Пропитывание материала заливочной средой, состоящей из эпоксидных смол, до 24 ч.
8. Заливка материала эпоксндными смолами с добавлением катализатора и последующим помещением его в термостат (60 'С) для полимеризации до 24 ч. 9. Заточка н резка блока. 10. Окрашивание срезов: а) получение полутонких срезов и окрашивание их метиленовым синим; б) получение ультратонких срезов с последующим окрашиванием их (контрастированием) раствором уранилацетата (1 — 2 ч)„а затем раствором цитрата свинца (20 — 30 мин). ЗАДАНИЯ 1. Запишите в тетрадь требования, предъявляемые к гистологическому препарату (см. с, 9) . 2.
Отметьте и таблице название основных этапов изготовления гистологического препарата и укажите кратко сущность каждого из них (см. Учебник, с. !6). Этапы и>тот 3. Заполните.каблицу. перечислив основные группы красителей, укажите название структур, воспринимающих краситель, н примеры красителей (см. с. 13).
!6 !7 Методика обработки материала для электронно-микроскопического исследовании 1. Быстрое взятие материала. 2. Фиксация в 2 — 4 % забуфсренном растворе глутаральдегида в течение 1 ч. ог>.> 3. Промт>вка материала буферным раствором (рН 7,3 — 7,4) 3 раза по 30 мин. 4, Постфиксация в ! % растворе тетраоксида осмия в течение 1 — 2 ч. 5. Промывка материала буферным раствором 3 раза по 30 мин. 6. Обезвоживание в спиртах восходящей концентрации (70 %, 90 %, 100 %) по 10 мин, в 100 % — 2 раза по 15 мин.
4. Заполните таблицу, отметив оснонные виды микроскопии, их разновидности, кратко сформулируйте цели использования каждой разновидности (см. Учебник, с. 11). ' В салан с тем что данное занятие янлнется нераым а курсе гистологии, патологии и амбриологиа, заданию длн самоконтроля усноення материала могут яа>полниться после сто аанершеиня. ГУродолженне щабл, Возможнзае ориентиры Программа действия Объект Залаяие Ю МЕТ ОтИЧКСКИЕ ЛАЗАНИЯ КОАМООТОЯТЯЛЬНОЙ РАБОТЕ НА ЗАНЯТИИ Объекты изучения ь Препарат — тонкая кишка; окраска гематоксилином и зозином 3.
Закрепить навык мнкроскопирования гистологического препа- рата Объект Программа действ Задавив зе ориеятиры 1. Ознакомиться с принципами изготовления гистологического пре- парата в Батареи для проводки и заливки материала в парафин и целлоидин Парафиновые блоки Микротом Батарея цля окрашивания срезов ° Выяснить основиьк пы приготовления г логического прела Сопоставить посвец тельность процедур пользуемых при фн ции, обезвоживании лотнсини материала, бором реактивов в б реях для его прова Познакомиться с мет ческими принципам прибором для изгото ния срезов. Г!ознаком ся с процедурой акра вания гематоксилпно зозином и провести о ску цсллоидиновых ср ст, помещенный зй заданий и под- 2 ° 1 — имеют форму пальцевидных вырастив, расположены на внутренней поверхности органа; 2 — покрывает поверхность ворсинок; 3 — окрашены в ° Препарат — тонкая кишка; окраска гематокснлином и зозином 4.
Изучить тинк ториальные свой ства гистологиче скнх структур ° См. Рис. 1 Микроскоп "Биолам" г,в устройство мик- роскопа ° Найти и сопостави новные части микро с изображенными и сунке уночные подписи ' Найти при малом увеличении: 1) ворсинки тонкой кишки; 2) слой эпителия. При болыпом увеличении обратить внимание на: 19 !8 1. Микронрепараты для самостоятельного изучения. ° Тонкая кишка. Окраска гемптоксилином и эозином. 2. Демонстрационные препараты.
° Яйцеклетка !сводит) млскопнташщего. Окраска азокпрмином ло Гейдснгнйну. ° Белая жировая ткань. Окраска суданом РД и гематоксилином. 3. Рисунки. ° Микроскоп для биологических исследований (см. Рис. 1). ° Этапы приготовления гистологического препарата для световой и электронной микроскопии (см. рис. 2). 4. Оснащение н технические средства для гистологических исследований. ° Батареи для проводки и заливки материала в парафин и целлоидин.
° Блоки с кусочками органов, залитых в парафин. ° Микротом и ножи для резки материала. ° Батарея для окрашивпния срезов гематоксилином и эозином. ° Микроскоп для свсгооптического исследования. Карти задипнй и ориентировочные основы действия ° установить микроскоп и выполвигь следующие манипуляции: 1) вровсрить положение объективов, кондснсора и состояние диафрагмы; 2) отрегулировать освещение с помощью вогнутого зеркала; 3) поместить препарат на предметный столик и сориентировать его с учетом обратного изображения микроскопа; 4) установить объектив малого увеличения на расшояиии 0,5 — 1 см от покровного стскла и, вращая винт макроподачи на себя, сфокусировать изображение.
5) выбрать участок среза для мик)хккопии прн болыпом увеличении; б) слегка подняв тубус<>- держатель, произнести замену объективов и установить объектив болылого увеличения на расстоянии не более 1 мм от покровного стекла; 7) вращая винт ма. кроподачи на себя, найти изображение и скорректи)ювать его винтом мнкроподачи; 8) опуская конденсор,скорректировать освещенность и контрастность изображения; 9) по окончании работы поднять тубусодержатель, придать микроскопу и препарату походное положение 1 — над столиком микроскопа установлен объектив малого увеличении кондеи сор поднят, диафрагма открыта; 2 — поле зрения освещено равномерно; 3 — препарат лежит покровным стеклом вверх, срез находится под объсктивом, внутренняя поверхность органа обращена к исследователю; 4 — установка объектива контролируется наблюдением сбоку, при правильной фокусировке четко видна структура органа Гпозможна корректировка микровинтом); 5 — изучаемый участок помещен в центр поля зрения; 6 — установка объектива контролируется наблюдением сбоку; 7 — при медленном вращении винта четко видны детали с~роения органа; 8 — с уменьшением освещенности контрастность изображения возрастает; 9 — установлен объектив малого увеличения, копдснсор поднят, препарат помещен в лоток или в ко- робку Продолжение табл.