Ю.И. Афанасьев, А.Н. Яцковский - Лабораторные занятия по курсу гистологии, цитологии и эмбриологии (1135293), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Москва, ул. Моховая, д. 11, кори. 3, ММА нм. И, М, Сеченова, кафедра гистологии. Раздел 1 ТЕХНИКА ГИСТОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ЭТАПЫ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ГИСТОЛОГИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА, МЕТОДЫ И ТЕХНИКА МИКРОСКОПИИ Основными видами работы на лабораторных занятиях по гистологии являются самостоятельное мнкроскопирование и изучение гистологических препаратов.
Анализируя структурные особенности гистологических объектов и характерные для них тинкториальныс свойства, исследователь имеет возможность получить представление о функциональном состоянии изучаемых клеток, тканей и органов. Существенно дополняет эту информацию использование гистохимических методов и специальных микроскопических методов исследования.
Успешное овладение микроскопической техникой и методами гистологического исследования создает условия для более глубокого изучения материала. Я Ознакомиться с содержанием ясяяяяых этяцяя язготояяецяя фяяея я яяря1яеяяогя гяетолягячеаяогв препарата. ° Получить представление о тяяятяяяяльяых аяойстяях структур я гяс скям цреяяряте. ° Пязяяяомнтьея с принципами работы я ясяяльзяяяяяя ярябяряя ец мяяряскяяяя я ясаяедояятеяьаяях целях. я Зяяреяяп яяяыя мяяросяяяцряяяяяя гистологического яреяярятя. 1еаь МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО САМОПОДГО ТОВКЕ ~Далее я цоаобяя ямеяуется "Учебник". Чл.-корр. РАЕН, заел.
деят. науки РФ, проф. л). И. Афанасьев ескяа приборы, используемые для ыякроскоциронацяя. ояом я электронном микроскопах. 3. !'азрешакццая способность я уяелячеяяе микроскопа. 11о теме занятия 1. Методы цссяедовяняя я гистологии (ея. Учебник, с, Ш), 2. Окраска срезав я тяякторяяльцыа свойства гистологических структур (см. а. 13). С оптической частью связано осветительное устройство, кото. рос включает в себя з е р к а л о (с одной стороны вогнутое, которое использу.
ют при источнике света, рассеивающем лучи, с другой — плоское); к о н д е н . сор, с помощью которого пучок света фокусируется на препарате; ириса в у ю д н а ф р а г м у, вмонтированную в кондснсор для изменения степени ос. вещенности препарата. С помощью зеркала пучок света посылается в конден. сор н через него на препарат (при изучении препарата в проходящем свете). Механическая часть. Оптическая часть микроскопа соединена механиче. скими частямн. К ним относят п!тат ив, колонку с микро- и макровинта. ми, тубус.
Увеличение, получаемое в микроскопе, определяют произведением увели. чения объектива на увеличение окуляра. Наиболее распространенные в нашей стране микроскопы типа "МБИ" и "Биолам" дают увеличение до 2000 раз. А В 4 В Рис. 1. Микроскоп длн биологических исследонаиий. А — общий анд:! — оеаоаанне: 2 — т б — — — у оеодержателы 3 — тубуь! 4 — коробка механизма мнкролодачн; 5 — реаольаериое уетройетео; 6 — предметный ото!; 7-- знк; -- макрометрнчеекий аинзч 8— мнкрометрический аиит; 9 — вивт конденеора; !Π— ок ; 11 — б — окуляр; — о ъектнаы; !2 — конденеор е нриеоаой диафрагмой( 13 — зеркало; Б — объективы малого (а), бо (б) г а, лысого ( ) н иммереионаого (а) уаеличеннй.
На первом занятии необходимо вспомнить устройство биологического микроскопа, технику микроскопирования, а также познакомиться с принципами приготовления гистологических препаратов для световой и электронной раскопии. р мнк- Микроскон Основным прибором, который используют студенты на занятиях, является световой ми к оск р о п. Он позволяет получить увеличенное и обратное изображение объекта. В м части (рис.
1). икроскопс различают оптическую и механическую Оптическая часть. Эта часть вклк)чает в себя объективы, устанавливаемые в гнезда револьверного устройства тубуса, окуляр, расположенный в тубусе, и осветительное устройство. О б ъ с к т и в — сло — ожная система линз. Чаще используют объективы х8, Х20, Х40, Х90. По особенност настям использования и конструкции объективы подразделяют на сухие (Х8, х20, Х40) и иммерсионные (Х90). О к у л я р увеличивает изображение, данное объективом. Чаще всего и и- меняют окуляры Х5, Х 7, Х10, Х15. Основной технической х ой характеристикой объектива является р а з р е ш ающа я способность, т.
е. , т. е. наименьшее расстояние, на котором две близлежащие точки объекта восп ринимаются раздельно. В световом микроскопе это расстояние определяется в основном длиной свет в й третьей части. о о волны и соответствует ее Техника микросконироиания Микроскопирование гистологического препарата начинают с установку.
! правильного освещения. Для этого с помощью вогнутого зеркала, собирающе. го рассеянный пучок света, н конденсора достигают равномерного освещений поля зрения. Препарат помещают на предметный столик покровным стеклом вверх. Изучение препарата начинают и р и м а л о м у в е л и ч е н и и, при этом расстояние между фронтальной линзой объектива малого увеличения и по- кровным стулом должно быть около ! см. Установку резкости проводят с помощью макровинта. Перемещая препарат на предметном столике, рассматри. вают его детали по всей площади. После изучения объекта при малом увсличе. нии устанавливают в центр поля зрения участок препарата, который следует изучить при большом увеличении.
Для этого с помощью револьверного устройства ставят объектив с более сильным увеличением (Х40). Установку резкости производят только с помощью микровинта путем вращения его на полоборота вперед или назад. Для изучения очень мелких гистологических структур используют и ммерсионный объектив (х 90). При этом на покровное стекло препарата наносят каплю иммсрсиониого масла (кедровое масло), после чего остораж.
но опускак)т тубус до прикосновения фронтальной линзы объектива к маслу, Используя микравинт. достигают четкого изображения. После окончания работы кедровое масло удаляют с объектива и покровного стекла марлей. Гистологическая техника Гистологические препараты, как правило, представляют собой срезы (толщиной 5 — 15 мкм) органов, тканей или клеток, окрашенныс специальными гистологическими красителями. Основные этапы приготовления гистологического препарата: 1) взятие и фиксация материала; 2) уплотнение; 3) получение срезов; 4) окрашиванне; 5) заключение в консервирующую среду (рис.
2). взятие материала 'еев Охраненные и смонтированные арвзы, готовые для микроскопии Взятый образец тини Э скрашивания )ко нтрастира ванне) срезав солями тяжелых металлов Рвзремннр ткани на кусачки' необходимого рамке)ю Фяжнция (глутарвльдвпгдом и др.) Ультратонквя резка стмвянными или алмазными накммн Промывание ткани буферам Контрастирование (окраюиванив) ткани в блоке Б дегидратацня спиртами еозраствюгинк концентраций Прапитыванив непалимеризоеаннод зализанной средой Заливка в зпокснднна смолу (эпон, аралдит н др,) и полимеризацня )ао" с) 4" Полимеризаввнный зпоксидный блок с тканью Эпоксидный бгюк с ланью в держателе для резки рис.2.
Продолжение. 10 Рис. 2. Этапы приготовлении гистологического препарата для световой (А) и электронной (Б) микроскопии. Гистологические препараты в зависимости от целей исследования могут быть временными (изготавливаются для однократного изучения) н иослталнньгми г',используются длительное время). В качестве среды, в которую заключают временный препарат, используют глицерин нли воду. Фиксация. Цель фиксации заключается в стабилизации живой системы, в остановке в ней процессов жизнедеятельности. При этом необходимо по возможности стремиться сохранить прижизненную структуру изучаемой системы, не вызвав в ней образования структур, не свойственных изучаемому объекту в норме — артефактов.
Ф н к с а т о р ы могут быть простые н сложные. К простым относят формалин (обычно 1Π— 12 % раствор), метиловый спирт, тетраоксид осмня (1 — 2 % раствор) н др. Сложные фиксаторы состоят из нескольких компонентов. На- пример, в состав смеси Буэна входят формалин, спирт, пикриновая кислота: состав жидкости Ценкера — уксусная кислота, сулема, бихромат калия, сул фат натрия. Продолжительность фиксации зависит от свойств фиксатора, размеров плотности объекта н обычно колеблется от 2 до 24 ч. Для быстрой фиксац материала используют небольшие образцы (0,5 — 2 см) органов, тканей.
Объ~ фиксатора должен превышать объем фиксируемого матери\ла в 20 — 30 р В большинстве случаев после фиксации объект промывают водой для удален фиксатора. В результате воздействия фиксатора исследуемый образец, как прави' несколько уменьшается и уплотняется. Однако этого уплотнения недостаточ для изготовления из образца материала тонких срезов. Уплотнение. Целью этого этапа изготовления гистологического препарата является придание исследуемому материалу такой плотности, которая позволит получить срезы необходимой толщины.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
