Ю.И. Афанасьев, А.Н. Яцковский - Лабораторные занятия по курсу гистологии, цитологии и эмбриологии (1135293), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Этого достигал>т двумя способами: замораживанием образца с последующей резкой на замораживающем микро- томе или пропитыванием уплотняюл!ими средами (парафин, целлоидин и др.). Для заключения в парафин или цсллоидин фиксированные образцы подвергают обезвоживанию, так как болыпинство фиксаторов является водными растворами, и вода не смешивается с уплотняющими средами. Дегидратации (промежуточный этап уплотнения) достигают проведением материала через ряд возрастающих концентраций спирта — 60 %, 70 %, 80 %, 90 % растворов и абсолютного — 100 % спирта. Заливка в парафин. Парафин при комнатной температуре находится в твердом состоянии, поэтому перед пропитыванием его подогревают в термостате до 52 — 56 'С.
Так как парафин не смешивается со спиртами, используют промежуточныс среды (ксилол, толуол и др.), которые смешиваются со спиртами, и растворяют парафин, обеспечивая постепенное пропнтыванне образца заливочной средой. После дегидратации образца в спиртах его переносят в смесь равных частей ксилола и абсолютного спирта, а затем в чистый ксилол. Далее материал погружают на несколько часов в смесь парафина и ксилола (при температуре 37 'С), потом на 1 — 2 ч в чистый расплавленный парафин (при температуре 52 — 56 'С), а затем переносят в формы (бумажные или металлическис).
Из затвердевшего парафина с заключенным в него образцом вырезан>т прямоугольный блок, который закрепляк>т расплавленным парафином на деревянном кубике. В таком виде материал готов для резки и получения тонких (4 — 6 мкм) серийных срезов в виде лент. Следует учитывать, что прн парафинированни происходит большее сжатие кусочка, чем при заливке в цсллоидин. Заливка в целлоидин.
Целлоидин — специальным образом приготовленная целлюлоза. После дсгидратации образец нз абсолютного спирта перс>и>сят в смесь из равных частей абсолютного спирта и безводного эфира, а затем в 2 %, 4 % и 8 % растворы целлоидина на несколько суток в каждый. Далее материал переносят в густой целлондин, который уплотняют в парах хлороформа. Из затвердевшего цсллондина вырезают блоки, наклеивают на деревянные кубики и для хранения помеща>от в 70 % спирт. Отрицательными результатами этой заливки являются длительность уплотнения (10 — 15 сут), невозможность получения срезов тоньше 7 — 8 мкм, сложность получения серийных срезов.
Изготовление срезов. Для получения срезов используют специальный прибор — м и крото м (см, рис, 2, А). В нем выделяют три основные части: объектодержатель (для закрепления деревянного кубика с блоком);микрометрическую механическую систему (для подачи объектодержателя на заданную величину); держатель микротомного ножа. Существуют различные конструкции микротомов. Микротомы, снабженные специальными охладительнымн столиками (замораживающие мик р о т о м ы ), используют в тех случаях, когда необходимо избежать воздействия фиксатора, например при гнстохимических исследованиях.
На микротомах этого типа получают срезы толщиной 10 — 20 мкм и более. Метод замораживания широко используют в патологоанатомической практике н в клинике как один из экспресс-методов диагностики. Замороженные срезы переносят в воду или сразу на предметное стекло, где они оттаивают и расправляются. 12 О ашивание срезов. Красители, применяемые в гистологической практикр ке, по химическим свойствам разделяются на три группь>: основные, кислые и нейтральные. Основные красители (азур Д, гематоксилин, кармин и др и р.) представляют собой соли красящих оснований. 1истологические структуры, избирательно окрашнвающиеся основными красителями, называют аб з о ф и л ь н ы м и.
Основные красители окрашивают ядра клеток. К и с л ы е к р а с н т е л и (эозин, кислый фуксин н др.) обычно окрашивают цнтоплазму и многие иеклеточные структуры. Гистологические структуры, окрашивающиеся кислыми красителями, называют оксифильными. Нейтральные красители с и т е л и представляют собой соли красящего основания и красящей кислоты. Существуют красители, обладающие способностью либо связываться с химическими компонентами, либо растворяться в них (например, в липидных каплях растворяется судан 111). Способность гистологических структур определенным образом окрашиваться теми или иными красителями называется т и н к т о р и а л ь н ы м и свойствами. Структуры, не реагирующие с красителями, называются х р о м офобными.
Окрашивающиеся структуры являются хромофильными (базофнльными, оксифнльными). В ряде случаев для характеристики тинкториальных свойств используется название красителя, с которым реагируют или не реагируют гистологические структуры. Например, пиронннофильные — окрашенные пнронином, суданофобные — не окрашенные суданом и т.
п. Иногда структуры, имеющие специфический химический состав, меняют прн окрашнвании цвет красителя, Такое тинкториальное свойство называется м е т ахромазией. Меуиоди>га окраьииааиил земптг>ксилином и эозином цслло идинг>вых срезов !. Окрасить в гематоксилине в течение 2 — 3 мин. 2. Промыть сначала в водопроводной, а затем в дистиллированной воде по 2 — 5 мнн. 3. Окрасить в эозине в течение 1 — 2 мин. 4. Промыть в дистиллированной воде в течение 0,5 — 1 мин.
5. Обезводнть в спиртах восходящей концентрации (70 %, 96 %, 100 %) по 1 — 2 мин. 6. Просветлить в карбол-ксилоле и ксилолс по 2 — 3 мин. 7. Заключить окрашенные срезы в бальзам. Методика окрашивания гематг»гси ином и эозином парафинг>вых срезов Фд' у~ ап 1. Наклеить срезы на предметное стекло. 2. Удалить парафин из срезов в трех порциях ксилола по 4 — 5 мин.
3. Удалить из срезов кснлол в абсолютном спирте в течение 2 — 3 мин. 4. Гндратировать срезы, проведя их через спирты нисходящей концентрации (96 %, 70 %) и дистиллированную воду в течение 2 — 3 мин. 5. Окрасить в водном растворе гематоксилина в течение 2 — 3 мин. 6. Промыть сначала в водопроводной, а затем в дистиллированной воде по 2 — 5 мин. 7. Окрасить в водном растворе эозина в течение 0,5 — 1 мин.
8. Промьггь в дистиллированной воде в течение 0,5 — 1 мин. 9. Обезводить в спиртах восходящей концентрации (70 %, 96 %, 100 %) по 1 — 2 мин. 1О. Просветлить в карбол-ксилоле и ксилоле по 2 — 3 мин. 11. Заключить окрашенные срезы в бальзам. Заключение срезов. В качестве консервирующей среды используют смолы ;войных деревьев — канадский, пихтовый бальзам, а также прозрачные зааты,ающие синтетические среды. Цито- и гистохимические методы исследования Цито- и гистохимические методы позволяют выявлять химические соедиения различных классов в структурах клеток и тканей, а также их локализаию.
Специфичность химической реакции в ряде случаев может быть провереа с помощью дополнительного контроля (например, путем предварительного асшепления соответствующим ферментом). В основу цито- и гистохимических методов исследования положен ряд принипов. 1. Избирательное окрашивание, при котором определенные химические группировки внутриклеточного вещества вступают в реакцию с красителем. > И . Избирательное растворение красителя в определенном субстрате, характеризующем клеточяую структуру.
5, П .. Перевод некоторых неактивных химических соединений, неспособных взаимодействовать с красителем, в активное состояние. 4. Получение с помощью промежуточных реакций неокрашенного продукта с последующим переводом его в окрашенный. Так, специфичной для выявления ДНК является реакция Фелыена, >торая основана на том, что альдсгидные группы дезоксирибозы восстанавли~ют окраску основного фуксина, предварительно обесцвеченного сернистой, >слотой (реактив Шиффа). В результате реакции хроматин окрашивается в ~рпурно-красный цвет. Для одновременного выявления ДНК и РНК часто >именяют метод Браше с использованием метилового зеленого и пиронина.
ри этом способе метиловый зеленый окрашивает ДНК хромосом в зеленый ~ет, а пиронин окрашивает РНК ядрышек и цитоплазмы в красный цвет. Выявлени ние гликогсна, гликопротеинов, гликолипи> в — соединений, содержащих сахара, основано на окислении гликолевых упп последних до альдегидов с последующим взаимодействием с реактивом яффа. П о к фф, р дукт реакции окрашивается в различные оттенки пурпурно-красго цвета. В случае выявления гликозаминогликанов (гиалуроновая кислота, ндроитинсульфат, кератансульфат, гепарансульфат, гспарин) используют особность их анионных групп связываться при низких значениях рН с основ>ми красителями или давать метахроматическое окрашивание с тиазиновыми асителями — толуидиновым синим, азуром.
Выявление лип идов основывается на их способности окрашиваться растворенными в них красителями, например суданом. Сочетание цито- и гисгохимических методов исследования с методом электронной микроскопии послужило основой развития электронной гистохимии. Электроииия микроскопия Многие структуры клетки находятся за пределами разрешающей способности светового микроскопа. Длина волны видимой части спектра лежит в пределах от 0,4 до 0,7 мкм, максимальное разрешение, полученное при этом с помощью светового микроскопа, может составлять 0,2 мкм.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
