Н.А. Юрина, А.И. Радостина - Гистология (1135282), страница 7
Текст из файла (страница 7)
хлористоводородную кислоту. Гидролиз производят в термостате при температуре 60' С в течение 8 — 15 мин (кислоту следует заранее согреть); 2) проводят обработку реактивом Шиффа при комнатной температуре в течение 40 — 80 мин. Склянка с реактивом должна быть защищена от света черной бумагой; 3) из реактива Шиффа срезы переносят в сернистую воду (ни в коем случае не споласкивая!) — 3 — 4 порции сернистой воды по 2 мин в каждой; 4) промывают в водопроводной воде в течение 10 мнн; 5) обезвожнвают в спиртах, помещают в ксилол, заключают в бальзам (методику обезвоживания и заключения см.
в главе 21). Р е з у л ь т а т: ядра окрашиваются в красньй цвет. Метод выявления РНК окрашиванием метиловым зеленьвм— пнронииом по Ъ'иие — Панпенгейму с контролем рибонуклеазой (реакция Браше). Использовать метод окраски Унны — Паппенгейма для выявления РНК было предложено Браше. При этом из пары соседних срезов один обрабатывают рибонуклеазой для разрушения РНК. Затем оба среза окрашивают метиловым зеленым — пиронином и сравнивают.
Материал, окрашивающийся в красный цвет пиронином и исчезающий на срезах, обработанных рибонуклеазой, представляет собой РНК. ДНК ядра красится метиловым зеленым в зеленый цвет. Во многих случаях, например при работе с нервной 32 тканью, обработки рибонуклеазой не требуется, так как в ней нет других, кроме РНК, компонентов, окрашивающихся пиронином. Наилучшим фиксатором для последующей реакции Браше является жидкость Карнуа.
Фиксаторы, содержащие тяжелые металлы, негодны, так как тяжелые металлы образуют с РНК устойчивые к перевариванию рибонуклеазой комплексы. Приготовление растворов. Метиловый зеленый необходимо очистить от образующегося в нем метилового фиолетового.
Для этого порошок метилового зеленого заливают хлороформом (10 — 15 мл хлороформа на 0,1 г красителя), основательно взбалтывают и оставляют на 2 — 3 ч. Затем снова взбалтывают и фильтруют. Порошок красителя на фильтре еще несколько раз промывают хлороформом. Высушенный порошок используют для приготовления раствора красителя. Можно обрабатывать метиловый зеленый хлороформом и в растворе. В атом случае раствор взбалтывают с хлороформом в делительной воронке и отделяют отслаивающийся, окрашенный в фиолетовый цвет хлороформ. Процедуру повторяют несколько раз до тех пор, пока хлороформ не перестанет окрашиваться. Для приготовления раствора метилового зеленого пиронина 0,5 г метилового зеленого растворяют в 100 мл 0,1 М раствора ацетатного буфера (см.
главу 21) с рН 4,4. К атому раствору прибавляют 0,2 г пиронина. Можно использовать и другую пропись: метилового зеленого 0,15 г, пиронина 0,25 г, спирта 96' 2,5 мл, глицерина 20 мл, 0,5'/» водного раствора карболовой кислоты 100 мл. Методика окрашивания: 1) депарафинированные срезы из дистиллированной воды переносят в метиловый зеленый— пиронин на 1 — 2 ч и более (до 1 сут); 2) срезы быстро споласкивают водой, быстро обсушивают фильтровальной бумагой.„3) быстро (10 — 15 с) обезвоживают и дифференцируют в абсолютном спирте или в безводном ацетоне; 4) помещают в ксилол, заключают в баль- Р е з у л ь т а т: ядра синевато-зеленые„РНК ядрышек и цито- плазмы розового цвета.
Ф е р м е н т а т и в вы й ко н т р о л ь. Срез обрабатывают в растворе рибонуклеазы в концентрации 0,1 — 0,5 мг/мл в термостате при 37' С в течение 4 — 8 ч. Ъ'частки клетки, содержащие РНК, после такой обработки пиронином не окрашиваются. Реакция на РНК по Браше не подходит для количественного анализа. Значительно надежнее выявление нуклеиновых кислот с помощью гаплоцианина и хромовых квасцов по Эйнарсону.
Выявление нуклеиновых кислот с использованием галлоциянииа и хромовых квасцов по Эйнарсоиу. При больших значениях рН галлоцианином и хромовыми квасцами окрашиваются все базофильные структуры. Специфически нуклеиновые кислоты окрашиваются при рН 0,8 — 1,75. Метод выявляет одновременно ДНК и РНК. Если необходимо выявить только ДНК или только РНК, срез предварительно обрабатывают рибонуклеазой (как указано выше) или дезоксирибонуклеазой. Последнюю растворяют в фосфатном зз буфере рН 6,5 — 7,0 (см. главу 21) в концентрации 0,2 мгlмл и в качестве активатора добавляют хлорид магния в концентрации 0,2 М. Обработку производят при температуре ЗT С в течение 4 — 6 ч.
К фиксации особых требований нет, но не следует употреблять фиксаторы, содержащие ртуть или бихромат. Приготовление раствора: 5 г хромовых квасцов (К 8О4Сгз ~8О4]„.24 Н О) растворяют в 100 мл дистиллированной воды, йрйбавляюзт 0„15 г галлоцианина; раствор кипятят в течение 5 мин, охлаждают, фильтруют и фильтрат доводят дистиллированной водой до 100 мл. Приготовленный распюр имеет рН 1,64 и, следовательно, вполне подходит для выявления нуклеиновых кислот. Раствор пригоден в течение длительного времени.
Методика проведения реакции: 1)депарафинированные парафиновые срезы из дистиллированной воды переносят в раствор галлоцианина и хромовых квасцов и окрашивают в течение 48 ч при комнатной температуре; 2) промывают водопроводной водой, ополаскивают дистиллированной водой; 3) обезвоживают в спиртах, просветляют в ксилоле, заключают в бальзам. Р е з у л ь т а т р е а к ц и и: нуклеиновыекнслотыокрашиваются в серовато-синий цвет.
Выявление а-аминокислот ииигидрииовой реакциеи по Ясума и Ичикава используется как общая реакция на белки. Пригоден материал, фиксированный любым способом. Необходимые распюры: 0,5% раствор нингидрина в абсолютном спирте или 1'4 распюр аллоксана. Методика проведения реакции: 1)депарафинированные срезы переносят из дистиллированной воды в раствор нннгядрина или аллоксана и выдерживают 16 — 24 ч при температуре ЗT С; 2) промывают водопроводной водой в течение нескольких минут; 3) проводят обработку реактивом Шиффа в течение 15 — 30 мин; 4) промывают в водопроводной воде 10 мин; 5) обезвоживают в спиртах, заключают в ксилол, бальзам.
Р е з у л ь т а т: белки окрашиваются в цвета от розового до красно-фиолетового. Окрашивая не гликогеиа методом реактив Шиффа — йодиая кислота. 1ШИК-реакцня) в модификации А. Л. Шабадаша. Метод основан на окислении полисахаридов перйодатом калия или натрия с образованием альдегидных групп, дающих реакцию с фуксинсернистой кислотой. В качестве фиксаторов можно рекомендовать насыщенный раствор пикриновой кислоты в абсолютном спирте, жидкость Карнуа, спирт-формол (на 9 частей абсолютного спирта 1 часть формалина) или фиксатор Шабадаша (спирт 96% 100 мл, нитрат меди 1,8 г, нитрат кальция 0,9 г, формалин 10 мл).
Кусочки материала должны быть тонкими (2 — 3 мм толщиной). Как до, так и после фиксации следует избегать контактов кусочков с водой, так как она растворяет гликоген. Материал можно залить в парафин и перед окрашиванием целлоидинировать. Для этого наклеенные на предметное стекло парафнновые срезы обрабатывают ксилолом и 34 96'/ спиртом, затем переносят на 1 — 2 мин в спирт-эфир и далее на 1 — 2 мин в 2/ раствор целлоидина. Вынимают стекла из целлоидина и дают ему стечь. Ждут, пока не образуется тонкая пленка (15 — 30 с)„ и переносят препараты на несколько минут в 70 — 80% спирт для уплотнения целлоидина.
Целлоидинирование защищает гликоген от растворения. Методика окрашивания целлоидиниров а н н ы х с р е з о в: 1) срезы ополаскивают в дистиллированной воде; 2) помещают в 0,23% распюр перйодата калия или в 0,27'/о раствор перйодата натрия на 15 — 25 мин (в темноте). Раствор перйодата готовят перед употреблением, используют 1 раз; 3) промывают в 2 порциях дистиллированной воды по 3 — 4 мин в каждой; 4) обрабатывают в сернистой воде 2 мин; 5) переносят в реактив Шиффа на 20 — 25 мин (в темноте); 6) обрабатывают в 3 порциях сернистой воды по 3 — 4 мин в каждой; 7) промывают в повторно сменяемой дистиллированной воде (10 — 15 мин); 8) докрашивают (по желанию) гематоксилином; 9) промывают водопроводной водой, обезвоживают в спиртах, просветляют в ксилоле, заключают в бальзам.
Р е з у л ь т а т: гликоген и другие углеводные компоненты окрашиваются в красный цвет. Исчезновение окраски после переваривания гликогена а-амилазой (0,5'/о раствор в дистиллированной воде), забуференной 4 мл ацетата до рН 5,5 — 6,0 30 мин — 1 ч при ЗT С, свидетельствует о том, что окрашенный продукт был гликогеном. Окрашиваиие липидов суданом 1П. Используют замороженные срезы материала, фиксированного в формалине (см. главу 21) или нефиксированного. Заливка в парафин или целлоидин невозможна, так как при использовании этих методов уплотнения жиры экстрагируются.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
