А.Т. Мокроносова - Малый практикум по физиологии растений (1134226), страница 37
Текст из файла (страница 37)
Луксииы действуют на процессы транскрипции, трансляции, влияют на физиологические функции к.леточной мембраны. Однако механизм ингибирующего действия ауксина на образование эмбриоидов окончательно не установлен. Действие цитокинина на соматический эмбриогенез еше менее изучено. Некоторые цнтокинины (бензнладенин, кинетин) ингибируют эмбриогенез, зеатин стимулирует его в узкой области концентраций. Изучение метаболических процессов, сопровождающих ранние стадии эмбриогенеза моркови, показало, что при индукции эмбриогенеза увеличиваются скорости синтеза ДНК, РНК и белков, В течение перехода от преглобулярной к глобулярной стадии наблюдают изменение в составе негнстоновых белков.
Особый интерес представляют биохимические маркеры эмбриогенеза у моркови. К маркерным свойствам относят синтез двух полипептидов (Е1 и Е2), а также инактивацию циклогексимида и а-аманитина, наблюдаемую только прн развитии эмбриоидов. Растительные клетки, способные образовывать органы или целые эмбриоды, при продолжительном культивировании обычно теряют это свойство. Уменьшение эмбриогенного потенциала может быть вызвано и мутациями. 111таммы культур клеток, которые потеряли эмбриогепный потенциал, исследуют в сравнении с эмбрпогенными штаммамн.
Таким образом выявляют особенности метаболизма последних и анализируют биохимические процессы, тесно связанные с ранним развитием эмбрноидов. После индукции соматического эмбриогенеза в клетках эмбриогенного ппамма моркови наблюдают изменение активности ряда ферментов и количества некоторых метаболитов (1. Саг!Ьегп, !987).
Так, активность пероксндазы значительно возрастает и появляются новые нзоформы, активность протеаз Уменьшается по сравнению с неэмбрногениым штаммом. С эм- 159 бриогенным потенциалом коррелирует также фенолоксидазная активность. При образовании эмбриоидов моркови увеличивается уровень полнаминов н активируется аргининдекарбоксилаза, В неэмброгенной культуре, растугцей на среде без ауксинов, метаболизм полнаминов не изменяется. Углеводный метаболизм в клетках, нндуцнрованных к эмбрногенезу, мало изучен, Известно, что органогепез в каллусной ткани ряда растений сопровождается накоплением крахмала на ранних этапах диф ференцировки. В эмбрногенных клетках моркови также содержится большее количество крахмала, чем в неэмбриогенных, Изучение 'метаболизма клеток на ранних этапах эмбриогенеза важно для понимания механизмов, контролирующих этот процесс.
РАБОТА 1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОНИЦАЕМОСТИ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК МОРКОВИ Цель работы. Определить проницаемость мембран по выходу электролитов из клеток суспензионной культуры моркови при индукции соматического эмбриогенеза. Объект исследованию эмбрногенная и неэмбриогепиая линии суспеизиониой культуры клеток моркови 1)аисиз саго!а 1., сорт Нантская, выращенной ва средах МС, содержащих и ие содержащих гормонов. Реактивы и оборудование: Зс)з-й раствор сахаровы; среда МС, содержащая 0,2 мггл 2, 4Д и О,! мг1л кинетина; среда МС, не содержащая гормоны; оборудование то же, что в работе ! (равд.
1, задача 1). Ход работы. 14-суточную суспензионную культуру клеток моркови фильтруют в стерильных условиях через сито с диаметром пор 120 мкм. Фильтрат оставляют на 30 мин для осаждения клеток, затем удаляют надосадочную ж~ггдкость с помощью стерильной пипетки и шприца. В оставшемся осадке с небольшим количеством среды определяют число клеток и мелких агрегатов в ! м,л. Для определения плотности культура должна состоять из одиночных клеток или маленьких групп клеток. Чтобы разделить клеточные агрегаты, суспензию обрабатывают раз.личными мацерирующимн веществами. Например, суспензию клеток смешивают с 10%-м раствором Н,Сг,Ог в отношении 1: 1.
Смесь помещают в термастат при 60'С на 1 ч. Мацерацию мояспо также проводи~ь с помощью смеси ферментов: 2%-й раствор целлюлазы, Онозука )с 10, 1%-й раствор мацерозима 1т 10, 1,5%-й раствор дрцзелазы в 0,7 М маннпте, содержащем 0,5%-й раствор СаС1,. Перед подсчетом клеток суспензию энергично встряхивают. Клетки подсчитывают в гемоцнтометре с сеткой Фукс — Розенталя. Подсчет ведут в четырех больших квадратах по диа- 160 топали счетной камеры. Проводят подсчет в 3 — 4 пробах. Чи- сло клеток (А) в 1 мл суспензии определяют по формуле 4л 1000 А— где а — число клеток в 4 больших квадратах, Гг — объем камеры (3, 2 ммз).
После определения плотности культуры суспензию рассевают на две среды (содержащую 2, 4Д н киветин и не содержащую гормоны) из расчета 0,5 — 2,5 1О' клеток на 1 мл среды. Суспензию клеток помещают на качалку (120 качаний(мин) при температуре 26' С, освещенности 700 лк. Через 4 дня суспензионную культуру клеток каждого варианта фильтруют через капрон с диаметром отверстий 30 мкм, осадок 3 раза промывают раствором сахарозы, обсушивают фильтровальиой бумагой. Взвешивают на торснонных весах 6 навесок по 30 мг массы клеток каждого варианта, помещают навески в бюксы, приливают по 10 мл раствора сахаровы. 3 бюкса ставя~ в термостат прн 25'С на ! ч, 3 бюкса — в кипящую водяную баню на 15 мпн.
После инкубаппн жидкость из бюксов сразу фильтруют через капрон (поры — 30 мкм) в чистые бюксы, остужпвают их до комнатной температуры и определяют электропроводность кондуктометрическим методом. Оформление работы. Рассчитайте количество электролитов, вышедших пз клеток каждого варианта, в процентах от полного их выхода (при кипячении). Сравните полученные данные. Сделайте выводы.
РАБОТА 2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ АМИЛАЗ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК МОРКОВИ Цель работы. Определить влияние состава среды культивирования (с гормонами и без них) на активность амилаз в клетках эмбриогенной н неэмбриогенной линий моркови. Объект исследоваиияг см. работу 1. Реактивы и оборудование: 0,005 М фосфатиый буфер, рН 7,4; свежепрвготовлениый !зй-й раствор крахмала з 0,005 М фосфатиом буфере; 3,5- дииптросалициловая кислота (приготозление см, в Приложении !); ступки б с пестиками, центрифужные пробирки; стеклянные пробирки; мерные проирки объемом !О мл; цилиндры объемом 50 мл; пипетки; териостат с температурой ЗT С; водяная баня с температурой !00' С; технические весы; центрифуга; центрвфужные весы; ФЭК.
Ход работы. См. опыт 5 (равд. П, задача 1, работа 1). Оформление работы. Рассчитайте активность амилаз в миллиграммах мальтозы на 1 г сырой массы клеток за ! мин. Сравните активность в различных вариантах, Сделайте выводы. 161 РАБОТА 3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ПОЛИФЕНОЛОКСИДАЗЫ В КАЛЛУСЕ И СУСПЕНЗИОННОИ КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК МОРКОВИ Полифгнолоксидаза (ПФО) — фермент, осуществляющий окисление о-дифенолов и о-гидроксилирование монофенолов (см задач 2, равд. 1Н, работа 3). Соединения феиольной при- роды широко представлены в растительных тканях.
Это про- стые феполы (папример, гндрохннон), фенольные кислоты (пи- рокатеховая кислота, р-гидроксибензойная кислота, галловая кислота и ее полнмсризованная форма — танннп и др.), гнд- роксикоричные кислоты (р-кумаровая. кофейная кислоты и др.), флавононды (антоцианы, флавоны, флавополы), лигни- ны н др. настоя- Биохимическая и физиологическая роль фенолов в > ' шее время окончательно не выяснена. Фенолы иногда рассмат- ривают как регуляторы роста и развития р астеннй. 1п у)(го показано нх действие па гормоны и нх синтез, >и у(уо возможно участие фенолов в образовании этилена нз метиоиина (эфир— р-кумаровой кислоты — необходимый кофактор для этого про- цесса). Выявлено изменение в фенольпом обмене в онтогенезе астений, при повреждениях.
На культуре клеток отмечены корреляции между синтезом антоцианов и эмбриогенностью культур ы клеток, изменение состояния и активности и оба- связи с эмбриогенностью клеток, активации ПФО при о ра- зованни корней. Появление активности полифенолоксидазы может быть индуцировано цАМФ. Цель работы. Определить активность ПФО в культуре кле- ток н тканей, выращенных в различных условиях. Реактивы и оборудование: см. разд. 1У. задача , р 2, абота 3. Кроме того, необходимы 1>'15 М фссфатпый буфер, рН 7,0; 0,04'>е-й раствор дпмстпл-р- ф >лепдппмппа и воде (спежеелрпотовплепвЫй; 120 мМ раствор СаСЬ; 35 -й пстеор сахпрозы; колбы объемом 25 и 2ьп — 500, .— еп>. — мл — 2 штд большие с хлпппые воронки-- 2 штл капроновая ткань с л-йр т с ячейками 60Х90 мхм, те, Объекты исследования: ппллусы моркови, выращена р .
уые в аплмчпых сх; с спепзпп клеток моркови, пырпшспнап пп культуральпых средах раз- лнчпого гормонального состава; резлпчпыс по змбрпсг . б генное>п линии сус- пепзппппой культуры клеток моркови. Ход работы. Работа состоит из двух этапов. 1, Подготовка растительного материала (см. задачу 2, работу 1 данного раздела) . 2 Определение активности ПФО. Навеску растительного материала (250 — 500 мг) растирают в ступке с небольшим количеством (!Π— 15 мл) фосфатпого буфера. Растертую массу переносят количественно в мерную колбу на 25 мл, >доводя> про у уф б б фером точно до метки, хорошо перемешивают и оставляют на 10 — 15 мин. Затем раствор фильтруют через двойной бумажный фильтр или центрифугируют !О мин при 4000 об>мин. Фильтрах (или 162 надосадочную жидкость) используют для определения активности фермента.
Активность фермента исследуют иа ФЭКе (7 ==590 нм). Об активности фермента судят по времени развитии окраски до определенной оптической плотности (значение оптической плотности — П выбирают в зависимости от скорости образования окраски в пределах от 0.025 †,4). Для анализа каждой биологической пробы используют три одинаковые кюветы для ФЭКа: одну — контрольную и днев опытные (две аналитические повторности пз одной биологической пробы). Во все три кюветы вносят; 4 мл вытяжки, 1 мп СаС1ш 1 мл диэтил-р-фенплеидиамииа. Затем в контрольную кювету приливают 2 мл воды н устанавливают ее в контрольную (дальнюю) кюветную подставку ФЭКа. Вводят ее в световой луч.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
