А.Т. Мокроносова - Малый практикум по физиологии растений (1134226), страница 38
Текст из файла (страница 38)
На ФЭКе устанавливают необходимую длину волны. Закрывают кюветную камеру и ручками грубой и тонкой регулировки устанавливают нуль на шкале оптической плотности по контрольному образцу. Одну из опытных кювет ставят в держатель и вводят ее в световой луч. Автоматической пипеткой вносят в опытную кювету 2 мл 1с1е-го раствора пнрокатехина н одновременно включают секундомер.
Пробу хорошо перемешивают стеклянной палочкой. Затем закрывают кюветную камеру н следят за развитием окраски по шкале оптической плотностп. Замечают по секундомеру время достижения необходимой оптической плотности. Аналогичные измерения производят и для второй опытной к>оветы. Расчет активности ведут по формуле, приведенной ранее (см. равд. !Н, задача 2, работа 3; У=2). Оформление работы. См. равд. 1, задача 1.
Результаты запишите в виде таблицы. Сделайте выводы об активности полифеиолоксидазы у исследуемых культур клеток моркови. РАБОТА 4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ПЕРОКСИДАЗЫ В КАЛЛУСЕ И СУСПЕНЗИОННОИ" КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК МОРКОВИ Пероксидазы — ферменты, окисляюшне субстрат при помощи пероксида водорода, играют, по-видимому, важную физиологическую роль в растениях (см. равд, 1Н, задача 2). На культуре клеток и тканей показано изменение изоферментпого состава и активности пероксидазы в ответ на изменение гормонального состава в среде выращивания.
Полагают, что пероксндаза, окисляя индолилуксусиую кислоту (ИУК-оксидаза), играет важную роль в регуляции гормонального статуса клеток и влияет на рост и развитие клеток и тканей. Цель работы. Определить активность пероксидазы в культуре клеток моркови в зависимости от их физиологического состояния. 163 Реактивы и оборудование: см. разд.
1У, задача 2, работа 2. Кроме то. го, необходимы: 3'/ь-й растно)) сахарозы; 0,2 М раствор КС( и 0,2 М ацстатном буфере, рН 4,3; 0,03 А-й раствор НсОы 0,17ь.й раствор гнаякола; 83 мМ раствор СаС!ы мерные колбы объемом 25 мл — 2 штк колбы объемом — 250 — 500 мл — 2 штл болыпне стеклянные воронки — 2 шт.; капроновая ткань с ячейками 60Х90 мкм. Объект исслсдоиаиия: клетки каллуса моркови различных линий; клетки каллуса, выращенного н различных условиях; змбриогенная и неэмбрпогенная культуры клеток моркови.
Ход работы. Работа состоит из двух этапов. 1. Подготовка растительного материала, Культуру клеток моркови готовят к опыту, как описано ранее (см. равд. Ру', задачу 2, работу 2). Каллус используют для анализа без предварительной особой подготовки. 2, Проведение оаьлта.
Навеску растительного материала (100 — 200 мг) растирают в ступке с небольшим количеством (10 — 15 мл) раствора КС( в ацетатном буфере. Растертую мас- су переносят количественно в мерную колбу объемом 25 мл, доводят пробу буфером точно до метки, хорошо перемешивают и оставляют на 10 — 15 мин. Затем раствор фильтруют через двойной бумажный фильтр или центрифугируют 1О мип при 1000 д. Филырат (или надосадочную жидкость) используют для определения активности фермента. Активность фермента исследуют на ФЭКе (А=440 нм). Об активности фермента судят по времени развития окраски до определенной оптической плотности (значение оптической плот- ности — Й выбирают ~в зависимости от скорости образования окраски в пределах от 0,025 до 0,4).
Для анализа каждой биологической пробы используют трн одинаковые кюветы для ФЭКа: одну — контрольную, две— опытные (две аналитические повторности из одной биологиче- ской пробы). Во все три кюветы вносят: 4 мл вытяжки, 1 мл СаС1ю 2 мл гваякола. Затем в контрольную кювету приливают 2 мл воды и уста- навливают ее в контрольную (дальнюю) кюветную подставку ФЭКа. Вводят ее в световой луч. Закрывают кюветную камеру и ручками грубой и тонкой ре- г)лировки устанавливают нуль на шкале оптической плотно- сти по контрольному образцу.
Одну из опытных кювет ставят в деря атель и вводят ее в световой луч. Автоматической пипеткой вносят в опытную кю- вету 2 мл НпО, и одновременно включают секундомер. Пробу хорошо перемешивают стеклянной палочкой. Затем закрывают кюветную камеру и следят за развитием окраски по шкале оптической плотности. Замечают по секундомеру вре- мя достижения необходимой оптической плотности. Аналогично производят измерения для второй опытной кюветы. Расчет активности ведут по формуле, приведенной ранее (см. равд. П(, задачу 2, работу 2; У=2). 164 Оформление работы. См.
равд. 1, задача 1. РАБОТА 5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАСТВОРИМЫХ САХАРОВ И КРАХМАЛА В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК МОРКОВИ АНТРОНОВЫМ МЕТОДОМ Метаболизм углеводов составляет одну из важнейших сго. рон в жизнедеятельности клетки. Углеводы являются основным субстратом дыхания растительных клеток и служат поэтому важнейшим фактором регуляции метаболическнх и энергетических процессов, сопряженных с дыханием. Изменение относительного содержания растворимых сахаров в тканях исползуют в качестве показателя метаболической активности ткачи. Значение сахаров не исчерпывается только участием их в энергетических процессах кле~ки. Возможно, они выполняют также важную роль в регуляции роста н развития растений. Показано, что соотношение растворимых (сахара) и нерастворимых (крахмал) форм углеводов изменяется в связи с ростом„ развитием и дифференцировкой клеток.
Отмечается связь между содержанием сахаров и репродуктивным морфогенезом в растениях. Для определения растворимых сахаров и крахмала в растительных тканях используют антроновсчй метод. Антроновый реактив образует синевато-зеленое окрашивание со всеми растворимыми углеводами, которые в одинаковой концентрации дают окрашенные растворы практически одной и той же оптической плотности. Это позволяет при определении различных углеводов использовать калибровочную кривую, составленную по глюкозе. Метод дает возможность определять крахмал н сахара в небольших концентрациях (до 0,2 мг в пробе) и пригоден для анализа вегетативных органов.
Цель работы. Изучить углеводный баланс в клетках каллусной ткани моркови и суспензионной культуры в связи с дифференцировкой, соматическим эмбрпогенезом, органогенезом. Реактивы и оборудование: спежеприготоплснный антронопый реактив (см. Приложение 1); 0,5уч-й раствор НьБОч (2,8 мл ссрнои кислоты — удельиап плотность 1,84 — растворяют н 1 л дистиллированной поды); 30%-й раствор сернокпслого цинка; ! 5 ьй -й раствор желтой кронянои соли— К~ 1Ре(СК)с] с 2НгО; стеклянные пробирка — 15 штс мерные колбы объемом 2о мл — 2 штз колбы объемом 250 — 500 мл — 2 штч пипетки объемом 2, 5, 10 мл; стеклянные воронки — 4 штл бюксы, доведенные до постоянной массы; капроновая ткань с ячейкой 60Х90 мкм; водяная баня на 100"' С; сушильные шкафы на 110 и 80'С; ФЭК.
Объект исследояания: каллус моркови; суспсизионная культура клеток моркови. В опытах используют культуры, выращенные при различных условиях освещения, питания, снабжения фптогормонами и др. Ход работы. Работа состоит из нескольких этапов. 1, Подготовка растительного ллатериала к оагиту, При работе с сйсаензионной культурой предварительно производят филырацию 165 клеток через капроновую ткань, а затем промывают осадок на фильтре три раза (250 — 500 мл) дистиллированной водой.
После полного удаления воды капроновый фильтр вместе с клетками поме!цают на влажную фильтровальную бумагу. Из подготовленного для анализа расти!ель!!ОГО материала берут три павески: одну для определения сухой массы и две— по 200 — 500 мг для антронового анализа. При работе с каллйсной ткинью материал непосредственно используют для определения сахаров и сухой массы.
1!авеску, взятую для определения сухой лиассы, помещают в бюксе в сушильный шкаф при температуре 110'С на 15— 20 мин, а затем в сушильный шкаф на 60'С и доводят до постоянной массы. 2, Опрепеяениг сахаров в растительных гкиыях, Две навески (по 200 †5 мг) помещают в две мерные колбы емкостью. о5 мл.
В одну колбу для свлслшрного определения сахаров и крахмалов добавляют 12,5 мл П2504 и гидролизуют на кипящей водяной бане в течение 15 мин (при этом происходит гидролиз крахмала). Затем добавляют цо 0,5 мл сернокислого цинка и желтой кровяной соли для осветления раствора, доводят обьем дистиллированной водой до метки и фильтруют через бумажный фильтр.
В другой колбе с навеской, предназначенной для определения растворимых сахаров, проводят извлечение сахаров в течение 1 ч с 20 мл воды при периодическом взбалтыванип. После этого экстракт осветляют, прибавляя по 0,25 мл растворов сернокислого цинка и желтон кровяной соли. Об ьем доводят до. метки и фильтруют. Берут по две пробирки для каждого экстракта н одну для контроля. Наливают по 3 чл антронового реактива и по 1 мл соответствующей вытяжки.
Контролем служат пробирки с 3 мл аитронового реактива, в которые прибавляют по 1 мл воды. Все пробирки быстро взбалтывают и помещают в кипящую водяную баню на 7 мин. После кипячения пробирки с растворами охлаждают до 20'С и затем определяют плотность синевато-зеленой окраски на. ФЭКе, применяя красный светофильтр (),=-6!О пм) против контрольной пробы. По калибровочной кривой рассчитывают содержание сахаров. 3. Построение калиброволной кривой. Для построения калибровочной кривой готовят исходно!й рве~вор глюкозы— 20 мг на 100 мл воды. Варьируя объем исходного раствора, вносимый в пробу, строят калибровочную кривую в интервале концентраций от 0 до 0,2 мг в пробе. Конечный объем пробы доводят до 1 мл дистиллированной водой.
К пробам добавляют по 3 чл антронового реактива, взбалтывают и помещают пробы в кипящую баню па 7 мин. После охлаждения проб до 20'С определяют плотность. 1бб я!краски на ФЭКе, применяя красный светофильтр ().=6!0 нм) против пробы, це содержащей глюкозы. Иа основании полученных данных строят калибровочную кривую па миллиметровой бумаге. 4. Рас!ет содержания растворимых сахаров и крахмала.
Вычпсленпя производят по формуле ау х р 100 !о где а — количество сахаров, найденное по калибровочной кривой, мг/мл; )т — объем экстракта, мл; Р— навеска, г. По результатам измерения экстракта в первой колбе узнают суммарное содержание сахаров и крахмала, а по результатам измерений экстракта из второй колбы определяют содержание свободных сахаров. Для вычисления количества крахмала разность между суммарным содержанием сахаров после гидролиза и до гидролиза умножают на Озй Оформление работы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
