С.С. Медведев - Физиология растений (DJVU) (1134223), страница 38
Текст из файла (страница 38)
Механическое взаимодействие клеток в ходе их развития приводит к натяжению (или сдвигам) клеточных лсембран, активации механочувствительпых каналов и появлению векторизованных ионных потоков, которые осуществляют уже непосредственную регуляцию процессов роста и дифференцировки. 5.2.4. Использование мембранных везикул для изучения мембранного транспорта ионов с и о и к к и о к о о » Рис. 5.12. Активный транспорт ионов Саз+ з везикулы плазмалеммы клеток колеоптилей кукурузы Стрелкой показан момент внесения АТР О) нлн АСР сй) н инкубационную среду, содержащую .. зоны Се~~ н везнкулы плазмалеммы, загруженные флуоресцентным зондом индо-1.
0 5.2.5. Метод петч-кламп регистрации ионного транспорта Появление метода петч-кламп (ра1СЬ-с)ашр), который позволяет осуществлять лоа,'кальную (точечную) фиксацию мембранного потенциала и измерять токи через оди',, ночные ио1шые каналы, в корне изл1енило методологию исследований электрических 159 Мембранную фракцию из клеток растений, обогащенную, например, фраглееитами :. плазмалеммы, получают путем центрифугирования в градиенте плотности сахарозы.
'.. Особенностью л~еыбранных препаратов, полученных таким образом, является способность фрагментов мембран самопроизвольно замыкаться в везикулы. При атом часть везикул ыожет ил1еть нормальную ориентацию, а другая их часть — инвертированную. С помощью осмотического шока везикулы плазмалеммы люгут быть заполнены средой, состав которой определяется задачами эксперимента.
Для количественной оценки интенсивности ионных потоков через мембрану используют флуоресцентные зопдьс В зависимости от конкретных задач применяют красители, принадлежащие к трем основным группам зондов: поеиемциалцувстеитсдьыые, йзменшощие флуоресценцию при изменении разности потенциалов на везикулярной мембране (аурамин, оксонолы, карбоцианины и др.), рН-зависимые, реагирующие из' ' менением флуоресценции на изменение граднепта концентрации ионов водорода (акридины), и, наконец, зонды, чувствительные к изл1енению концентрации какого-либо иона, например кальция (квин-2, Фура-2, индо-1 и,йр.).
На рис. 5.12 приведены результаты анализа АТР-зависимого транспорта ионов Саз+ ва везикулах плазл1алемыы, которые были получень1 методом дифференциального цен..: трифугировання из клеток колеоптилей кукурузы. Внутри везикул содержался кальций-чувствительный флуоресцентный зонд индо-1, загруженный с помощью осмотиче"- пюго шока. При добавлении к везикулам ионов Сад+ (10 мкМ) и комплекса Мя-АТР (3 мкМ) происходило постепенное увеличение флуоресценции зонда, что указывает на "=,: исступление ионов Са + внутрь везикул.
оп-се!1 ьтЕго!е-сеЕЕ Рис. 5.13. Способы измерения ионных токов методом петчнламп регистрации. оп-сеп — на миироучастие (ограниченном иончниом мииропипетки! с приирепленной платной Есе1ьвсысьед); иЬо1е-се!! — ст целой клетки а условинх плотного контакта; !ли!бели« вЂ” на изолированном участие мембраны, внещнва поверхность нсторой обращена внутрь пинегин; опм1беопс — внещнян часть мембраны обращена наруыз'. !пзЫе-оп! они Ые-он1 процессов и мембранного транспорта. Поянилась реальная возможность измерять токи и потенциалы в очень небольших клетках (3-10 мкм), регистрировать токи через '",': одиночные ионные каналы величиной в несколько пикоампер, проводить многие иссле- ','. дования в рамках традиционных электрофизиологических подходов.
Впервые метод петч-кламп регистрации ионных токон был введен в исследователь-,"~ скую практику в 1976 г., когда в журнале ЕсЕа1пге появилась работа Эрвина Нсйера (Е. ! ЕеЕ!ег) и Берта Сакмана (В. ЯаЕспгапп) «Токи через одиночные каналы в мембране волокна денсрвированной мьппцы лягушки». Общедоступным же этот метод стал толь- .',' ко после выхода в 1981 г. классической работы О. Хзыилла с коллегами (О. Р. ЕЕапн1! е.а.) «Усовершенствованный метод петч-кламп регистрации с высоким разрешением:-,".
от клеток и фрагментов клеточных мембрана. В 1991 г. Э. Нейеру и Б. Сакману была присуждена Нобелевская прел!ив по мццицнне и физиологии. Основой для создания метода петч-кламп в его современном ниде послужило обнаружение того факта, что при определенных условиях клеточная мембрана формирует необычайно плагпный контакт с поверхностью кончика стеклянного ыикроэлектрцца. при небольшом разрежении, создаваемом и!утри пипетки„между стеклом и мембранным фрагментол! формируется контакт, имеющий гигаомное сопротивление. В результате образуется электрически изолированный участок мембраны, и шум регистрируемого сигнала уменыпается на несколько порядков.
Контакт мембраны со стеклом мехй.- '':. нически очень прочен, поэтому находящийся под кончиком электрода фрагмент можно либо изолировать ог клетки, либо разрупгить. Существует несколько вариантов метода петч-кламп (рис. 6.13). Ионные токи через небольшие мембранные фрагменты измеряют с помощью стеклянных пипеток, у кото. рых диаметр кончика сравним с размерами фрагментов. Средняя площадь отверстия кончика пипетки варьирует от 1 до 8 ыкмз.
Наружная поверхность кончиков электродов изолируется хорошо прилипающим к стеклу гидрофобным материалом — силгврдои1й резиной. Особенностью нюастывшего силгарда является его способность растекаться тонкой пленкой по поверхности стекла. Поскольку высокоомные контакты образуются только с чистым стеклом, зту пленку необходимо удалять оплавлением электродов. Электронная схема для петч-кламп регистрации должна иметь такие параметры, чтобы было возможно зарегистрировать передвижение всего лишь нескольких сотен элементарных электрических зарядов через малый участок клеточной мембраны. Излсернтельнал аппаратура должна иметь максимально сниженные собственные шумы, не превышающие естественные токи.
Несмотря на то, что метод петч-кламп исходно был разработан для регистрации токов через одиночные каналы, он аюжет быть с успехом использован для измерения токов от целой клетки, оссбетпю когда ее размеры невелики. После образования гигаомного контакта мембранный фрагмент под пипеткой можно разрушить, прикладывая к ней короткие импульсы отрицательного давления.
Часто такая л1анипуляция не нарушает контакта пипетки с л1ембраной, и в результате между электродом и цитоплазмой устанавливается хорошо изолированный от внешней среды проводящий путь. Такой способ проникновения в клетку наносит ей гораздо меньше повреждений, чем введение стаццартного микроэлектрода. При измерении мембранных потенциалов с помощью классической микроэлектрод- ной техники большая часть клеток диаметром менее 20 мкм повреждается. Метод петчгч кламп позволяет успешно регистрировать мембранный потенциал клеток диаметром 10 мкм, нс разрушая их (рис.б.
14). Сопротивлегше утечки микроэлектрод — клетка при использовании обычных микроэлектродов не превышает 500 МОм, в то время как сопротивление угсчкн при тчЬо!е-се11 регистрации может достигать 20 ГОм. И, наконец, если сопротивление кончика обычного микроэлектрода (Л,) составляет более 100 МОм, то сопротивление кончика пипетки при плотном контакте равно 4 МОм. Поэтому метод регистрации при плотном контакте имеет ряд явных преимуществ по сравнению с ,другими методами. иЯЮ й4Ом ечки Э 10 ГОм Ка4 М К м1йб МОм Рис.
5.14. Методы регистрации мембранного потеициала и ионных токов 1Марти, Неер, 198Т). о--обычкая иикроелектродкая техпика; б — петч-клеил регистрация ст целой клетки (иьо1е-сен) при плотном коктакте. Однако наиболее корректную информацию о мембранной проводимости все-таки дает регистрация токов через одиночные каналы, поскольку позволяет избавиться от ряда артефактов, которые могут быть получены при регистрации макроскопического тока.
При эгоа1 появляется возможность измерить амплитуду тока через открытый канал, различать токи, проходящие через каналы разной проводимости. По записям токов через одиночные каналы можно получать информацию о кинетике работы канала, которую нельзя извлечь из макроскопических измерений. Это преимущество особенно очевидно при регистрации на фрагментах мембран, содержащих только один канал. 161 5.3. АССИМИЛЯЦИЯ НЕОРГАНИЧЕСКИХ ИОНОВ РАС'ГЕНИЯМИ Ассимиляцией называют процесс включения минеральных элементов в органические соединения. Для ассимиляции минеральных элементов (особенно азота и серы) необходим целый колшлекс биохимических реакций, в том числе и с затратой энергии. Например, в ходе редукции Ь10~ до оН4 расходуется 12 молекул АТР, в ходе фиксации Ь~з требуется 16 молекул АТР для восстановления одного атома азота, а на пути от 804 до цистеина расходуется 14 л«олскул АТР. Процесс ассимиляции ряда других элементов, особенно Саг«, Мбг+ и микроэлементов, включает формирование комплексов, в которых металлы связываются с органическими соединениями координационными связями с образонанисм хелатов.
Эти металлоорганические комплексы очень стабильны и при удалении лгеталла теряют свои функции. 5.3.1. Ассимиляция азота Живые организмы различаются по способности ассимилировать различные формы .,". азотистых соединений. Микроорганизмы способны усваивать молекулярный азот, растения могут использовать лишь лгинервльные формы азота, а животные — только азат органического происхождения.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
