П. Зитте, Э.В. Вайлер, Й.В. Кадерайт, А. Брезински, К. Кернер - Ботаника. Учебник для вузов. Том 1. Клеточная биология. Анатомия. Морфология (1134214), страница 21
Текст из файла (страница 21)
Этим были заложены основы общей биологии. Постепенно, по мере постоянного расширения возможностей наблюдения с помощью микроскопа и в результате первых исследований в области клеточной физиологии (например, осмоса), следовали дальнейшие открытия.Во второй половине XIX столетия все четчевырисовывались три основных положения цитологии.• Все живые организмы построены из клеток• Многие организмы одноклеточные.• Индивидуальное развитие многоклеточных организмов начинается — по крайней мерепри половом размножении — с одноклеточной стадии.Примерно в 1880-е гг.
в результате новогозначительного усовершенствования микроскопической оптики, осуществленного Э.Аббе,впервые было достигнуто максимальное теоретически возможное разрешение 0,2 мкм. Одновременно был достигнут заметный прогресс втехнике изготовления препаратов для микроскопии.К 1900 г. были описаны вообще все органеллы клетки, видимые при световой микроскопии (рис 2.2).После повторного открытия законов наследования Г.Менделя к началу XX столетия в течение последующих 40 лет основное вниманиестали уделять ядру и хромосомам (кариология,цитогенетика).Взрывообразное развитие исследованийклетки после 1945 г.
— в области ультраструктуры, биохимии и молекулярной биологии — опятьже было связано с техническим прогрессом:появился электронный микроскоп и были разработаны фракционирование клетки с помощью ультрацентрифуги (бокс 2.1) и рентгеноструктурный анализ биологических макромолекул. В последнее время принципиально отличные методики наблюдения и препарирования сильно расширили возможности исследования живых клеток.
Это имеет особое значение при переходе от эры геномики к эре протеомики.76[ ГЛАВА 2. СТРОЕНИЕ И УЛЬТРАСТРУКТУРА КЛЕТКИКлеточнаястенкаВакуольЯдроХроматинЯдрышкоWМитохондрияОлеосомаПластида(хлоропласт)Рис. 2.2. Растительная клетка в поле светового микроскопа (А — по D. von Denffer; В, С — интерференционный; D — фазовый контраст):А — схема клетки из паренхимы мезофилла листа высшего растения; В — хлоропласты в клеткахлисточка листостебельного мха {Mnium undulatum, ЗООх); С — клетки эпидермиса лука репчатого(Allium сера) в интерференционном контрасте (130х): крупные клетки почти целиком заполнены центральной вакуолью; в пристеночном слое цитоплазмы, который утолщен по углам, находится ядро сядрышком; D — область ядра клетки Allium, как на С, фазовый контраст (ЗЮОх); в ядре хроматин иядрышко, в цитоплазме лейкопласты (два из них со светлыми включениями крахмала), вытянутыемитохондрии и округлые олеосомы2 1 Изучение клетки |2 .
1 . 1 . Световая микроскопияОбъектив светового микроскопа (СМ)(рис 2 3) дает (аналогично объективу диапроектора) увеличенное изображениеобъекта (препарата), которое можно сфотографировать Это промежуточное изображение рассматривают через окуляр, какчерез лупу Самые мелкие, еще различимые детали объекта должны быть на расстоянии не менее 0,2 мкм (200 нм) другот друга Макромолекулярные структурыклетки остаются неразличимыми Тем неменее С М сохранил свое значение и после появления электронного микроскопа,имеющего значительно большее разрешение Он позволяет наблюдать объекты вживом состоянии и требует значительноменьших затрат на подготовку препаратовПоскольку клеточные структуры в большинстве своем бесцветны и даже по преломлению света лишь немного отличаются друг от77друга, они часто остаются невидимыми дажетогда, когда их размеры превышают границуразрешения Соответственно в классическойсветовой микроскопии исследуют преимущественно фиксированные (убитые с сохранением структуры) и искусственно окрашенныепрепараты Оптически анизотропные клеточные структуры, как, например, клеточныестенки, зерна крахмала и веретена ядерногоделения, можно рассматривать и в живых клетках с помощью поляризационного микроскопа,позволяющего также анализировать их макромо пекулярное строение На сегодняшний деньза счет оптических манипуляций, которые невлияют на сам объект, решена проблема контраста За счет фазового контраста или дифференциального интерференционного контраста(ДИК, DIC) фазовые различия световых волнпосле прохождения через препарат трансформируются в различия в контрасте или рельефную картину (см рис 2 2, С, D, 2,81, 3,9) Особенно нежные клеточные структуры можносделать видимыми при цифровой фотосъемкеи ее обработке Далее этот материал накапливают для обработки с помощью компьютер-Рис.
2.3. Современный научно-исследовательский световой микроскоп (Axioplan, Carl Zeiss)А— вид сбоку, елевой стороны, В — ход световых лучей 1, 2 — освещение для просмотра материала в проходящем свете и на непрозрачном фоне 3 — микровинт для точной установки на резкостьстолика 5, 4 — конденсор для освещения светового поля фазового контраста и дифференцирующего интерференционного контраста DIC, 6 — турель с объективами, над ней гнездо для световыхи поляризационных фильтров и др оптических приставок, 7 — бинокулярный тубус, 8 — автоматическая камера для микросъемки, 9 — глаз78| ГЛАВА 2 СТРОЕНИЕ И УЛЬТРАСТРУКТУРА КЛЕТКИной техники — видеомикроскопия Пространственное воспроизведение клеточных структурвозможно за счет конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (КЛСМ, CLSM) Приэтом мы имеем дело с томографией в микроскопических размерах препарат в интактном,неизмененном виде рассматривают как сериютончайших оптических «срезов», а затем с помощью компьютера из них составляется еговиртуальное пространственное изображениеТакую объемную реконструкцию живого объекта можно рассматривать на экране под любымуглом В отдельных изображениях оптическихсрезов (они строятся по растровому принципу, т е строчка за строчкой укладываются, какв кино) микроскопические детали чаще всегоразличимы значительно лучше, чем в самомпрепарате, так как в результате обсчета данных удаляются мешающие наслоенияВыявлению и локализации определенныхмолекул в клетке служат цитохимические методы Среди них важн>ю роль играют особочувствительные флуоресцентные методы Вофлуоресцентном микроскопе препарат освещают коротковолновым светом, а соответствующие вещества в препарате возбуждаются ииспускают более длинноволновые кванты (флуоресценция) Для получения изображения препарат рассматривают через светофильтр, непропускающий возбуждающее излучение, такчто освещенными остаются только флуоресцирующие части объекта Поскольку лишь немногие компоненты клетки хорошо флуоресцируют сами по себе, был разработан целыйряд методик для специфического флуоресцентного окрашивания определенных молекулОсобое значение при этом имеет иммунная флуоресценция Она основана на крайней специфичности белков-антител иммунной системымлекопитающих, что позволяет точно локализовать в клетке различные белки, полисахариды или нуклеиновые кислоты, действующиекак антигены (например, рис 2 10)1 В последнее десятилетие быстро расширяется использование зеленого флуоресцентного белка (greenfluorescent protein, GFP) в качестве флуоресцентного маркера Он выявляет генную ак-1Методика окрашивания состоит из нескольких этапов 1 Нанесение антител к определенному антигену на препарат, при которомпроисходит специфическое связывание 2 Отмывка от антител, которые не связались с препаратом 3 Нанесение вторичных антител с ковалентно связанным с ними флуоресцирующими молекулами Вторичные антитела реагируютс иммобилизованными на клеточных структу-тивность в живых клетках, а для определенных белков позволяет также исследовать их появление, локализацию и поведение (ср рис2 83, С)Многообразные флуоресцентные методыдополняют уже часто применявшуюся раньшемикрорадиоавтографию Этот чрезвычайно чувствительный метод основан на специфическомвстраивании радиоактивных изотопов в определенные вещества/структуры живых клеток(например, меченного тритием тимидина вДНК, соответственно 3Н-уридина в РНК или3:>8-метионина в белки) На фотографическойэмульсии, которой покрывают тонкие срезымеченых клеток/тканей, после соответствующей длительной экспозиции в темноте и проявления над структурами препарата, содержащими радионуклиды, образуются зерна серебра(рис 2 4)При многих исследованиях важно целенаправленно манипулировать отдельными клетками Для этого имеются дорогостоящие микроманипуляторы, причем в последнее время всечаще вместо механических устройств использ>ют лазерные («оптические пинцеты»)Наряду с новыми методами наблюдения спомощью светового микроскопа важную рольиграет ряд других современных методов исследования клетки Часто основой их служит выращивание генетически однородных клеточныхклонов в культуре клеток (см рис 2 1) Протопласты, путем ферментативного воздействиялишенные стенки, позволяют применить целый ряд методов, которые сначала были разработаны для клеток животных и человекаК ним относятся искусственное слияние клеток (см рис 2 49) и методы patch-clamp (см6 2 3 2, бокс 6 1) для исследования ионныхканалов и рецепторов Чтобы иметь возможностьнаправленно манипулировать отдельными клетками, клеточная мембрана должна хотя бы временно и/или локально становиться проницаемой, что позволяло бы экспериментально влиять на те или иные параметры клеточного обмена веществ (ионная среда, значение рН,энергетический уровень и др ) Таким целямслужат специально подготовленные пермеали-рах первичными антителами 4 Отмывка от несвязавшихся вторичных антител Только послевсех этих процедур препарат рассматривают вмикроскоп Столь сложная методика требуетпостановки многочисленных контролей, без которых нельзя достоверно судить о распределении изучаемых антигенов в клетке — Примечред2 1 Изучение клетки'Л*Ж'Л'% jifPJroB£L1.^гЗ^Шк*,т79Рис.
2.4. Микрорадиоавтограмма(В—Е —препараты и съемки в темном поле D Staiger иС Hemtzen)А — ткань кончика корня лука репчатого послепульс-метки 3 Н-тимидином Ядра, ДНК которыхреплицировалась во время пульса (S-фаза, см2 2 3 5) после проявления фотоэмульсии, проведенной над срезом, заполнены многочисленными черными гранулами серебра Немеченыеядра находились во время обработки радиоактивным изотопом не в S-фазе Свободные отДНК клеточные структуры не были мечены 3 Нтимидином (380х), В —Е — выявление транскриптов (мРНК) путем гибридизации in situ синтетическими радиоактивными РНК-зондами напоперечных срезах побега горчицы (Smapisalba) В — с проводящими пучками L, коровойтканью R и камбием, стрелка, С, D — различная транскрипционная активность гена одногоиз РНК-связывающих белков в зависимости отвремени суток (С — максимальная в конце светового дня, камбий особенно интенсивно связывается с меченым РНК-зондом, D — минимальная, метка не выявляется, одревесневшиечасти проводящих пучков светятся в темномполе и не будучи мечеными) Е — мРНК для белка клеточной стенки образуется только во внешних клетках коры (60х)ления клеточной мембраны, долго не сохраняющиеся) Альтернативу представляют собойметоды микроинъекции Вводить макромотекулы в живые клетки можно также путем электропорации (созданием проницаемых участковна клеточной мембране путем кратковременных электрических импульсов) и баллистическими методами или биолистикой (на частицызолота или вольфрама диаметром примерно1 мкм наносят препарат ДНК или РНК и с помощью ударной волны включаются, например,в ткань листа)' Такие методы позволяют, например, специфически блокировать определенные ферменты в живых клетках вводимыми антителами, а также искусственно изменять тезированные клетки1 (их клеточная мембранастановится проницаемой под влиянием детергентов) или так называемые клеточные модели (отчасти активные остатки клетки после уда1От англ permeable — проницаемый Терминпрактически не испопьзуется в отечественнойлитературе — Причеч ред1Исходно в биолистике использовали патроны, заряженные порохом, и производиливыстрел из ружья (так называемой «пушки») Насегодня разработаны щадящие методы созданияударной волны за счет сжатых газов или в соленоиде, позволяющем придать ускорение частицам металла за счет сил магнитного поля —При меч ред80[ ГЛАВА 2.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
