Б. Альбертс, А. Джонсон, Д. Льюис и др. - Молекулярная биология клетки (djvu) (1129766), страница 84
Текст из файла (страница 84)
5' пмптппгппппгпп З ДНК-хеликазы были сначала выделены как белки, которые гидролизуют АТР при свя зывании с одноцепочечными ДНК. Как было описано в главе 3, гидролиз АТР может ци клически изменять форму молекулы белка, что позволяет белку производить механическую работу. ДНК хеликазы используют этот прин цип, чтобы быстро продвигаться по одинарной нити ДНК.
Наталкиваясь на область двой ной спирали, они продолжают продвигаться по своей цепи и таким образом расклинивают спираль со скоростью до 1 000 пар нуклеотидов в секунду (рис. 5.14 и 5.15). АТР АОР+ Р, АТР АОР+ Р Рис. 5.14. Опыт для проверки ферментвтивной активности ДНК-хеликвз. Короткий фрагмент ДНК атжигвется с длинной цепью ДНК вЂ” чтобы сформировать небольшую область двойной спирали ДНК Двойная спираль плавится по мере того, квк хеликэза продвигается по одинарной нити ДНК, высвобождая воротний фрагментДНК входе реакции, для осуществления которой необходимо наличие и белка хеликвзы, и АТР.
Быстрое скачкообразное движение хели казы обеспечивается гидрализом связанных с ней молекул АТР 1см. рис. 3 771. Многие ДНК хеликазы сосюят из шести субьединиц, как зто показэно нв схеме АТР АОР+ Р, что самокорректирующаяся полимераза не может начинать синтез цепей Ие посо, подразумевает также, что фермент, который начинает цепи сызнова, не может быть эффективен в плане самокоррекции. Таким образом, любой фермент, который на чинает синтез фрагментов Оказаки, будет неизбежно делать относительно неточную копию (по крайней мере 1 ошибку на 105 нуклеотидов). Даже если бы такие копии, остающиеся в конечном продукте, составляли не более 5 ь всего генома (напри мер, 10 нуклеотидов на 200-нуклеотидный фрагмент ДНК).
то обусловленное этим возрастание общей частоты мутаций было бы огромным. Поэтому кажется весьма вероятным, по использование РНК, а не ДНК в качестве затравки дает клетке колоссальное преимущество: рибонуклеотиды в затравке автоматически помечаются как «подозрительные копии», чтобы их эффективно удалить и заменить. е) Рис. 5.15. Структура ДНК-хеликазы. а) Общая схема этого белка в виде гексамерного кольца. 6) Схема, показывающая репликационную вилку ДНК и хеликазу в одном масштабе. в) Подробная структура репликационной хеликазы бактериофага ТТ, определенная рентгенодифракционным анализом. Шесть идентичных субъединиц связывают и гидролизуют АТР упорядоченным способом для продвижения этой молекулы подобно ротационному двигателю по одинарной нити ДНК, которая проходит через центральное отверстие.
Красные области показьеают расположение связанных с ферментом молекул АТР. (Изображение блюбеэно предоставил Ебшагв Н. Еве1гпап; иллюстрация в заимствована из ЗЛ. К. 51п81етоп ет а)., Сев 101: 589-800, 2000. С великодушного разрешения издательства Е!зеч!ег.) Две цепи ДНК имеют взаимно нротивоноложнук> полярность, и, в принципе, хеликаза может раскручивать двойную спираль ДНК, двигаясь в направлении 5'-+ 3' но одной нити или в направлении 3' — + 5' .— По другой. Фактически существуют ДНК хеликазы обоих типов. В наиболее хорошо изученных системах ренликации бактерий хеликаза, движущаяся но матрице отстающей цепи в нанравлении 5' — > 3', но видимому, исполняет главенствующую роль — причины этого станут нам ясны вскоре.
Белки, связывающие одноценочечную ДНК (ЮВ-белки; 81нд!е.з1гапд 1ЭХА-Ь)нс))нд ргоЕетз), также называемые дестабилизирук>и)ими спириль бел кими, связываются прочно и кооперативно с открытой одноценочечной ДНК, не закрывая нри этом оснований, которые поэтому остаются доступными для спаривания. Эти белки не способны сами расплетать длинную спираль ДНК, но они содействуют хеликазам, стабилизируя раскрученную однонитевую кон формацик>. Кроме того, благодаря кооперативному связываник> они охваты вают и распрямляют облагти однонитевой ДНК -- матрицы отстающей цени, таким образом предотвращая образование коротких двусниральных шпилек, каковые легко образуются в одноценочечной ДНК (рис. 5.16 и 5.17).
Такие двусниральные шпильки могут быть помехой синтезу ДНК, катализируемому ДНК полимеразой. 5.2. Механизмы репяикации ДНК 421 5.2.7. Скользящее кольцо удерживает движущуюся ДНК-полимеразу на ДНК В большинстве своем молекулы ДНК-полимеразы сами по себе успевали бы синтезировать лишь короткую цепочку нуклеотидов и сразу бы срывались с матрицы ДНК. Стремление быстро отделиться от молекулы ДНК позволяет молекуле ДНК-полимеразы, которая только что закончила синтезировать один фрагмент Оказаки на отстающей нити, вновь быстро быть пущенной в оборот и начать синтез следующего фрагмента Оказаки на той же нити. Такая высокая скорость диссоциации, однако, мешала бы полимеразе синтезировать длинные цепи ДНК в репликационной вилке, если бы не было вспомогательного белка, который выполняет роль регулирующего скользящего зажима (в11г(!пав с)ашр). Этот зажим прочно удерживает полимеразу на ДНК, когда она передвигается, но отпускает ее, как только полимераза наталкивается на двухцспочечную область ДНК.
Каким образом скользящий зажим может препятствовать полимеразе диссоциировать и в то же время не создает помех быстрому продвижению полимеразы по молекуле ДНК? Трехмерная структура белка-зажима, определенная с помощью рензтенодифракционного анализа, показывает, что он образует большое кольцо вокруг двойной спирали ДНК. Одна сторона кольца связана позади ДНК-полимеразы, а все кольцо свободно скользит по ДНК вместе с перемешаюшейся полимеразой. Сборка зажима вокруг ДНК требует гидролиза АТР, что осуществляет специальный белковый комплекс, погрузчик, или установщик зажима (с!шпр!оадег): он гидролизует АТР, когда «насаживает» зажим в месте соединения затравки с матрицей (рис.
5.18). На матрице ведущей нити движущаяся ДНК-полимераза прочно связана с зажимом, и так они остаются связанными долгое время. На матрице отстаюшей нити ДНК-полимераза также использует зажим, но каждый раз, достигая 5'-конца предыдущего фрагмента Оказаки, полимераза освобождается от зажима и отделя ется от матрицы. Далее эта молекула полимеразы связывается с новым зажимом, собранным на РНК-затравке следующего фрагмента Оказаки. 5.2.8. Белки в репликационной вилке действуют сообща, образуя настоящую репликационную машину Хотя мы рассматривали репликацию ДНК так, как если бы она выполгилась смесью белков, работающих независимо один от другого, в действительности большин ство белков обьединено в крупный и упорядоченный мультиферментный комплекс, который быстро синтезируег ДНК.
Этот комплекс может быть уподоблен крошечной швейной машине, состоящей из белковых узлов и приводимой в действие энергией, вырабатываемой посредством гидролиза нуклеозидтрифосфата. Подобно швейной машине, репликационный комплекс, вероятно, остается неподвижным относитель но своего непосредственного окружения; ДНК можно рассматривать как длинную полоску ткани, быстро протягиваемую через нее. Хотя репликационный комплекс наиболее интенсивно изучался у Е сой и нескольких из поражающих ее вирусов, у зукариот, как мы увидим чуть позже, работает во многом схожий комплекс. На рнс.
5.19, а представлена вся совокупность функций, выполняемых субье диницами репликационной машины. Находящаяся перед репликационной вилкой ДНК-хеликаза расплетает спираль ДНК. В самой вилке — одна на опережающей нити, другая на отстающей нити — работают две молекулы ДНК-полимеразы. Тог да как молекула ДНК-полимеразы на ведущей нити может работать непрерывно, установщик зажима а) б' й зажим зажима зажим зажатая полимвраэа '©~® Рис. 5.1В.
Регулируемый скользящий зажим, ноторый удерживает ДНК-пол имеразу на ДНК. а) Структура белка-зажима у Е, согб определенная методом рентгеновской кристаллографии, с добавленной к изображению спиралью ДНК вЂ” чтобы показать, как белок образует кольца вокруг ДНК. б) Структура состоящего из пяти субъеди ниц к погрузчика зажима ь напоминает винтовую гайку, а канавки ее резьбы совпадают с бороздками ДНК.
Он, как предполагается, сжимается вокруг места присоединения праймера до тех пор, пока его дальнейшее продвижение не блокируется Зсконцом затравки; в этой точке погрузчик гидролизует АТР и отпускает зажим. в) Схематичная иллюстрация, показывающая, ха к зажим собирается, с тем чтобы удерживать движущуюся моле кулу ДН К- полимеразы на ДНК.
В упрощенной реакции, показанной здесь, погрузчик зажима уходит в раствор, как только зажим собран. В реальной репликационной вилке по грузчик зажима остается вблизи налиме разы на отстающей нити, готовый к сборке очередного зажима в начале каждого нового фрагмента Оказаки (см. рис. 5.19). (Изображение а заимствовано из Х Р Колй ет а)., Сей 69: 425-437, 1992.
С великодушного дозволения издательства Е)зегйег Схема в взята из б. О. Ватппап, М. О'Ооппей апг) 1 Кипуап, ЛГатиге 429: 708 — 709, 2004. С любезного разрешения издательства Маспкйап Рибйзбегз Егг).) белок, связыаающийся с одноцепочвчной ДНК РНК-затравка новый фрагмент Окаэаки заканчивающая синтез ноаосинт Фрагмента Оказаки цепь на отстающей цепи новосинтезироеанная ведущая цепь а) матрица для синтеза новосинтезированная ведущей цепи цепь ДНК-полимераэа ДНК-праймаза родительская скользящий зажим спираль ДНК и установщик зажима .-::,, -"-- ";":.У4бЪ~ х.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
