Б. Альбертс, А. Джонсон, Д. Льюис и др. - Молекулярная биология клетки (djvu) (1129766), страница 88
Текст из файла (страница 88)
За метилирование всех имеющихся у Е. сад последовательностей Сгдтс отвечает один-единственный фермент — метнлаза Рат. Задержка в метнлнровании после реплнкации последавательнопей ВАТС у Е. соб используется также системой коррекции ошибок спаривания — для распознавания недавно синтезированной нити ДНК от материнской; так что значимые для такога случая последовательности ВЯТС рассеяны по всей хромосоме и не связаны белком 5еа А дом, известным под названием авторадиографии.
Время радиоактивного мечеиия подбирают таким образом, чтобы обе репликациоииые вилки успели продвинуться по ДНК иа несколько микрометров, — тогда реплицироввциая ДНК в световом микроскопе будет видна в виде полосок из серебряных зерен, хотя сама молекула ДНК слишком тонка, чтобы быть заметной. Таким образом, с помощью данной методики можно определить и скорость, и направление движения репликациоипой вилки (рис. 5.29). 1!о скорости, с которой следы реплицируемой ДНК растут в длину с увеличением времени мечеиия, темпы движения репликационных вилок оценивают ггример>го в 50 иуклеотидов в секунду.
Это приблизительно одна десятая скорости продвижения бактериальиых репликационных вилок, что, быть может, отражает повышенную сложность реплицироваиия ДНК, плотно упакованной в хроматии. Среднего размера хромосома человека содержит одну линейную молекулу ДНК размером приблизительно 150 миллионов пар нуклеотидов, На репликацию такой молекулы ДНК от начала до конца в едииствениой репликациоицой вил ке, движущейся со скоростью 50 иуклеотидов в секунду, ушло бы 0,02 секунды иа иуклеотид х 150 10" иуклеотидов = 3,0 10ь секунд (приблизительно 800 часов). Поэтому, как и следовало ожидать, только что описанные авторадиографические эксперименты показывают, что по каждой хромосоме эукариот одновремецио лви жется множество репликациоииых вилок. Дальнейшие эксперименты этого типа показали следующее.
1) Точки начала репликзции, как правило, активируются кластерами, названными репликационныии единицами, которые могут включать в себя 20 — 80 точек. 2) Новые репликациоииые единицы, по. видимому, акгивируются в разные периоды клеточного цикла, пока вся ДНК ие будет реплицироваиа (к этому моменту мы еще вернемся позже). 3) В пре Рис. 5.30. Четыре последовательных фазы стандартного клеточного цикла у эунэриот. Во время 6,—, 5- и 6,-фэз клетка непрерывно растет.
Во время М-фэзы рост останавливается, ядро делится, и клетка делится надвое Репликэция ДНК ограничена той частые клеточного цикла, которая нэзывэется 5-фэзой. 6,— промежуток между М-фэзой и 5-фэзой; 6 — промежуток между 5-фэзой и М-фазой. около 8 часов; в клетках более простых эукариот, наподобие дрожжей, 8 фаза может занимать не более 40 минут. К ее окончанию каждая хромосома реплицирована с образованием двух полных копий, которые остаются соединенными одна с другой сво ими центромерами до начала И фазы (М означает лгитоз), которая вскоре наступает. В главе 17 мы описываем систему контроля, которая управляет клеточным циклом, и объясняем, почему для вхо да в каждую очередную фазу этого цикла нужно, чтобы клетка успешно завершила предыдугцую фазу.
В следующих пунктах мы разберем, как координируется репликация хромо сомы во время Я фазы клеточного цикла. В клетках млекопитающих на полную репликацию ДНК в области, располо женной между двумя точками начала репликации, должно, как правило, уходить лишь около часа (учитывая скорость перемещения репликационной вилки и наи большие расстояния, измеренные между точками начала репликации). И все же 8 фаза в клетке млекопитающих обычно длится примерно 8 часов. Это подразуме вает, что не все точки начала репликации активируются одновременно и что ДНК в каждой репликационной единице (которая, как мы упоминали ранее, содержит группу из приблизительно 20 — 80 точек начала репликации) реплицируется в течение только малой части всего временного периода 8 фазы. Случайным ли образом актнвируются различные репликационные единицы, или различные области генома реплицируются в заданном порядке? Один из воз можных способов ответить на этот вопрос — это использовать аналог тимидина, бром дезоксиуриднн (ВггИ)), для мечения недавно синтезированной ДНК в синхро пизированных популяциях клеток, добавляя его через короткие промежутки времени на протяжении всей Я-фазьь Позже, во время М.фазы, те области митотических хромосом, которые включили ВггШ в свою Д11К, могут быть идентифицированы по изменившемуся окрашиваникз или в реакции с анти Вгг(1)-аггтителами.
Результаты показывают, что разные области каждой хромосомы реплицируются во время 8 фазы в воспроизводимом порядке (рнс. 5.31). Более того, как и ожидали, анализ реплика ционных вилок, наблюдаемых на авторадиограммах ДНК (см. Рис. 5.29), показал, что репликации скоординированы во времени на обширных областях хромосомы. Теперь существуют намного более тонкие методы для того, чтобы отслеживать инициацию репликации ДНК и наблюдать движение репликационных вилок ДНК ранняя средняя поздняя 8-Фвзв 8-Фвзв 8-Фвзв 0-2 часа З-б часов В-в часов Рис.5.31 Разные области хромосомы реплицируются в разные периоды 5-фазы.
Нз этих оптических микрофотографиях показаны окрашенные миготические хромосомы, в которых реплицирующвяся ДНК дифференциально метилась в течение разных заданных интервалов предшествующей 5-фазы. В этих экспериментах клетки сначала выращивали в присутствии Вгг(Ц (зналогз тимидина) и в отсутствие тимидннз — с целью равномерного мечения ДНК. Затем эти клетки кратковременно и нкубиро вал и в среде с тимидином в отсутствие Вгбн во время ранней, средней или поздней 5-фазы.
Поскольку ДНК, синтезируемая в присутствии тими- дина, представляет собой двойную спираль с тимидином в одной нити и Вгдц — в другой, го онв окрашивается темнее, чем остальная ДН К (которая имеет Вгдп в обеих нитях), видимая в виде яркой полосы (сгпрелки) на этих негативах. Штриховые линии соединяют соответствующие позиции на трех идентичных копиях представленной хромосомы.
(Снимок любезно предоставлен Е(топ 5тоьыебе!6 ) в клетках. Эти подходы основаны на использовании микрочипов ДНК вЂ” сеток размером с почтовую марку, усеянных десятками тысяч фрагментов известной по следовательности ДНК. Как мы увидим подробно в главе 8, каждый отдельный фрагмент ДНК помещен в уникальную позицию на микроматрице и целые геномы могут таким образом быть представлены в четком порядке.
Если образец ДНК из группы клеток, пребывающих в Я фазе, разбить на фрагменты и гибридизовать на микрочипе, представляющем геном этого организма, то может быть определено количество каждой гнзследовательности ДГ! К. Поскольку фрагмент генома, который был реплицирован, будет содержать вдвое больше ДНК, чем нереплицированный участок, запуск репликационной вилки и движение вилки можно точно прослеживать таким способом (рис.
5.32). Хотя этот метод обеспечивает намного более высокую точность, полученные с его помощью результаты согласуются со многими из тех выводов, которые сделаны по итогам предшествующих исследований. 5.3.6. ВЫСОКОКОИДОИСИ(ЗОЛВИИЫЙ ХРОВЯвтмм РОЛЛИЦИГЗ)(втСЛ ЛОЗДИОг 7ОГДВ Как ГЮИЫ В РИНОЮ УПЛОтм!ВИИОВЯ КРОЬЗвтИИВг Кви ЛРВВИЛО, Гзюллмцируизтся рвио По-видимому, порядок активации точек начала репликации зависит отчасти от структуры хроматина, в котором зти точки пребывают. В главе 4 мы узнали, что гетерохроматин представляет собой особенно уплотненное состояние хроматина, тогда как эухроматип упакован менее плотно, что, очевидно, необходимо для осуществления транскрипции.
Гетерохроматин, как правило, реплицируется очень поздно во время В-фазы, а это предполагает, что хронометраж репликации увязан с упаковкой ДНК в хроматине. Данное предположение подтверждается анализом двух Х хромосом в клетке женской особи млекопитающего. При том что обе эти хромосомы содержат, по суще ству, одни и те же последовательности ДНК, одна доступна для транскригщии ДНК, а другая — не активна (обсуждается в главе 7). Г1очти вся неактивная Х хромосома конденсирована в гетерохроматин, и ее ДНК регглпцируется во время поздней Я фазы.
Ее активный гомолог менее угиотнен и реплицируется на всем протяжении Я фазы. Ел;~иф~Фар(цф((з(~!р(а)((г(((((в4(аидййекревк)с(зма)с' ''439: культура дрожжевых клеток, развитие остановлено до стадии начала репликации ДНК инициирована реппикация Еьмгщ, НЕТ РЕПЛИКАЦИИ ИНИЦИАЦИЯ СИНТЕЗА ПРОДОЛЖЕНИЕ ДНК ПОЛНОСТЬЮ В ТОЧКЕ НАЧАЛА ПРОЦЕССА РЕПЛИЦИРОВАНА РЕПЛИКАЦИИ РЕПЛИКАЦИИ Рис. 8.32. Применение ДНК-чипов для отслеживания образования и продвинмния репликационных вилок в геноме почкующикся дрожжей. Для этого эксперимента популяция клеток синхронизируется, так что все клетки начинают репликацию в одно и то же время.
ДНК выделяют и гибридизирукп на микрочипе; ДНК, которая была реплицирована однократно, дает гибридизационный сигнал (птемнозеленые квадрагпихо) вдвое более интенсивный, чем сигнал нереплицированной ДНК (саегмо зеленые квадрата или). Пятна на этих микроматрицах представляют следующие по порядку последовательности на участке хромосомы дрожжей, расположенные слева направо, сверху вниз.
Здесь показано только 81 пятно, но настоящие матрицы содержат десятки тысяч последовательностей, которые охватывают полный геном дрожжей. Как можно заметить, репликация начинается в некоторой точке и развивается в двух направлениях. Для простоты здесь показана только одна точка начала репликации. В клетках дрожжей репликация начинается в сотнях точек, разбросанных по всему геному. Эти данные говорят о том, что в первую очередь реплицируются те области генома, где хроматин наименее уплотнен.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
