Б. Альбертс, А. Джонсон, Д. Льюис и др. - Молекулярная биология клетки (djvu) (1129766), страница 85
Текст из файла (страница 85)
„,В".'"л й ' '.: -т";,,"!,"".'::,:„. ДНК-хепиказа „матрица для синтеза ДНК-полимераэа, е) новосинтезированная отстающая цепь Рис. 5.19. Активная репликационная вилна. а) На этой схеме показано взаимное расположение белков в реплика цион ной вилке в процессе синтеза ДН К. ДНК отстающей нити свернулась, чюбы свести моле нулу ДНК-пол имеразы на отстающей нити в один ном иле кс с молекулой ДНК-палиме разы на лидирующей нита Кроме того, в результате такой укладки Зсконец каждою законченного фрагмента Оказали оказывается вблизи участка начала следующею фрагмента Оказаки.
Посксльку молекула ДНК-полимера вы на отстающей нити остается связанной с остальными репликацион ными белками, она может мноюк ратно использоваться для синтеза последовательных фрагментов Она заки. На этой схеме она собирается выпустить завершенный ею фрагмент ДНК и перейти к РНК затравке, которая будет синтези ров э на поблизости, что необходима для начала следующего фрагмента ДНК.
Дополнительные белки (не показаны) помогают удерживать различные белковые компоненты вилки вместе, что позволяет им работать как хорошо согласованная белковая машина. б) Электронная микрофотография, показывающая репликационную машину бактериофага Т4 в момент ее продвижения па матрице, когда она оставляет позади себя новосинтезированную ДНК. е) Интерпретация этой микрофотографии дана в эскизе: обратите особое внимание на петлю ДНК на отстающей нити Очевидно, реплика ционные белки частично отделились от ДНК непосредственно перед реплика цион ной вилкой ва время подготовки этого препарата для электронной микроскопии. (Фотоснимок б любезно предоставлен ЗасЫ боба; см. Р.
О. Сйээга~п ет а!., З. Вго(. С(геях 278: 21275-212В5, 2003.) 424 Часть 2. Основные генетические механизмы молекула ДНК-полимеразы на отстающей нити должна начинать свою работу вновь и вновь через короткие промежутки времени, используя короткую РНК-затравку, тут же изготавливаемую молекулой ДНК-праймазы.
Тесное сотрудничество всех этих белковых компонентов увеличивает эффективность репликации и становится возможным благодаря определенной укладке отстающей нити «петлей назад», как показано на рис. 5.19,а. Кроме того, такая организация облегчает установку зажима полимеразы при каждом цикле синтеза фрагмента Оказаки: погрузчик зажима и молекула ДНК-полимеразы на отстающей нити остаются на своих местах как часть белковой машины, даже когда они отделяются от своей матрицы ДНК. Репликационные белки, таким образом, связаны друг с другом в единый большой комплекс (полная молекулярная масса > 10» дальтон), что позволяет ДНК синте зироваться по обе стороны репликационной вилки согласованно и эффективно.
На отстающей нити реплицирующая ДНК машина оставляет позади себя ряд фрагментов Оказаки с незаделанными зазорами между ними, которые на своих 5'-концах все еще содержат РНК, которая затравливала их синтез. Эта РНК уда ляется, и образующийся зазор заделывается ферментами репарации ДНК, которые работают позади репликационной вилки (см. Рис, 5.12). 5.2.9. Ошибки репликации, которые допускает репликационная машина, удаляет направляемая цепью система исправления ошибок спаривания Как было сказано ранее, бактерии наподобие Е.
соД способны делиться один раз каждые 40 минут, благодаря чему имеется возможность сравнительно легко проводить массовый анализ больших популяций, чтобы найти редкую мутантную клетку, видоизменившуюся в определенном процессе. Представители одного инте ресного класса мутантов содержат изменения в так называемых генах-мутаторах, которые значительно увеличивают частоту самопроизвольных мутаций. Не уди вительно, что один такой мутант производит дефектную форму 3' -+ 5' корректи рующей экзонуклеазы, которая является частью фермента ДНК-полимеразы (см.
рис. 5.8 и 5.9). Мутантная ДНК-полимераза не может эффективно корректировать ДНК, и многие ошибки репликации, которые в ином случае были бы удалены, накапливаются в ДНК. Изучение других мутантов Е. со1(, проявляющих аномально высокую частоту мутаций, выявило систему коррекции неправильного спаривания (ппвша(сп ргоо(геаб1пп зуз(еш), которая удаляет ошибки репликации, допущенные полимеразой и пропущенные корректирующей экзонуклеазой. Такая направляемая цепью система исправления ошибок спаривания (эггар-с(1гессед ппзшассЬ гера(г) вы являет потенциальные места искажений в спирали ДНК, что обусловлено плохой «подгонкой» оснований некомплементарных друг другу.
Если бы такая корректирующая система попросту узнавала ошибки спаривания в недавно реплицированной ДНК и случайным образом исправляла один из двух несоответствующих друг другу нуклеотидов, то точно в половине случаев она ошибочно «исправляла» бы исходную матричную нить, приводя ее в соответствие ошибке, и, таким образом, средняя частота появления ошибок ничуть не снизилась бы.
Чтобы быть эффективной, такая корректируюп1ая система должна различать и удалять несоответствующий нуклеотид только на вновь синтезированной нити, в которой и произошла ошибка репликации. а) СВЯЗЫВАНИЕ БЕЛКОВ СИСТЕМЫ КОРРЕКЦИИ НЕПРАВИЛЬНОГОСПАРИВАНИЯ ошибка в навосинтвзироввнной цепи ДНК ВЫЯВЛЯЕТ ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫЙ РАЗРЫВ В НОВОЙ ЦЕПИ ДНК Мцнз Мцй. НИЕ ЦЕПИ ! РЕПАРАЦИОННЫЙ СИНТЕЗ ДНК Рис. 5.20. Модель направляемого цепью исправления ошибок спаривания у зукариот.
а) Два изображенных белка присутствуют каку бактерий, так и в клетках эукариот: Мнт5 специфично связывается с комплементарными основаниями, тогда как Мнтг просматривает близлежащую ДНК на предмет наличия разрыва. Как только Мосс находит разрыв, он запускает деградацию разорванной нити на всем протяжении несоответствия оснований принципу комплементарности. Поскольку у зукариот разрывы главным образом возникают в пределах новореплицированных нитей ДНК, то ошибки реплика ции удаляются избирательно. У бактерий механизм тот же самый, за исключением того, что дополнительный белок в комплексе (Мотн], проиллюстрированный на данной схеме. 6) Структура белка Мит5, задача которого убрать ошибки на ДНК.
Зтот белок представляет собой димер, который, как показана, захватывает двойную спираль ДНК, образуя петлю ДНК в области некомплементарных оснований. Кажется, что белок Мит5 кпросматривает» ДНК, ища ошибки путем проверки наличия участков, которые могут быть легко согнуты, потому что составляющие ее основания не образуют нормальной комплемента рной пары.
!Изображение б заимствовано из 6. ОЫпо)оча ет а!., ЛГагиге 407: 703-710, 2000. С любезного разрешения издательства Массы))ап Рцы)зйегз |.тг),) Б.27 ййахаииавая репникафв~ДЙК 425 У Е. со1т механизм различения нитей, используемый системой исправления ошибок спариванги, связан с метилированием определенных остатков А в ДНК. Метильные группы присоединяются ко всем остаткам А в последовательности САТС, но лишь по прошествии некоторого времени после включения Л в ново синтезированную цепь ДНК.
В результате неметилированные последовательности СТАТС встречаются только в гювосинтезированных нитях сразу после репликаци онной вилки. Распознавание таких неметилированных последовательностей САТС позволяет в течение короткого периода отличать новые нити ДНК от старых, что и требуется для избирательного удаления ошибок, допущенных именно при репли кации. Состоящий из трех этапов процесс включает в себя распознавание ошибки спаривания, вырезание сегмента ДНК, содержащего зту ошибку, из новосинтези рованной нити и повторный синтез вырезанного сегмента с использованием старой нити в качестве шаблона. Такая направляемая нитьк> система корректировки еще в 100 раз уменьшает число ошибок, допущенных в ходе репликации ДНК (см. таблицу 5.1, стр. 414).
426 Часть 2. Основные генетические механизмы Подобная система коррекции ошибок спаривания несет свою службу и в клетках человека (рис. 5.20). Вся значимость этой системы становится очевидной при взгляде на особей, которые унаследовали одну дефектную копию гена исправления ошибок спаривания (наряду с функционально активным геном на другой копии хромосомы).
Такие люди имен>т выраженную предрасположенность к некоторым типам рака, Например, при разновидности рака кишечника, называемого наслед. ственный неполипозный колоректальный рак (НХРСС), самопроизвольная мутация второго, функционально активного, гена производит клон соматических клеток, которые, поскольку в них не выполняется коррекция неправильного спаривания, накапливают мутации необычайно быстро. Болыпинство видов рака возникает в клетках, которые накопили множественные мутации (см, рис, 20.11), и поэтому клетки, лишенные возможности исправлять ошибки репликации, имеют все основания стать злокачественными.
К счастью, большинство из нас наследует обе доброкачественные копии гена, который кодирует белок коррекции неправильного спаривания; и это защищает нас, так как очень мала вероятность того, что в одной клетке мутируют сразу обе копии.
В клетках эукариот механизм распознавания новосинтезированной цепи от ро дительской матричной в месте неправильного спаривания не зависит от метили рования ДНК. И в самом деле, у некоторых эукариот — в их числе дрожжи и дрозофила — не происходит метилирования ДНК. Недавно синтезированная ДНК отстающей нити непродолжительное время имеет надрезы (прежде чем они будут зашиты ДНК-лигазой), и биохимические эксперименты показывают, что такие надрезы (называемые одноцепочечными разрывами) являются сигналом, который нацеливает систему коррекции неправильного спаривания на должную нить (см. рис.
5. 20). Логично предположить, что для работы такой системы также необходимо, чтобы вновь синтезированная ДНК на ведущей нити имела кратков ременные разрывы — как это происходит, пока еще не ясно. 5.2.10. Спутывание ДНК во время реппикации предотвращают ДНК-топоизомеразы При продвижении репликационной вилки по двунитевой ДНК возникает про блема, которая получила название «проблемы закручивания» (ччпгйпй ргоЫет) ДНК.
Дело в том, что каждые 10 пар нуклеотидов, реплицированных в вилке, соответствуют одному полному обороту вокруг оси родительской двойной спирали; поэтому, для того чтобы репликационная вилка могла двигаться, вся хромосома перед вилкой должна была бы вращаться с большой скоростью (рис. 5.21). В случае длинных хромосом это потребовало бы большого количества энергии, и поэтому тут используется альтернативная стратегия: в спирали ДНК образуется шарнир, который формируют белки, известные под названием ДНК-топоизомераз. ДНК топоизомераза может рассматриваться как обратимая нуклеаза, которая сама ковалентно соединяется с фосфатом основной цепи ДНК и таким образом разрывает фосфодиэфирную связь в нити ДНК.
Эта реакция обратима, и фосфодиэфирная связь вновь образуется, как только белок уходит. Топоизомераза первого типа, названная топоизомеразой 1, производит времен ный однонитевой разрез; этот разрыв фосфодиэфирной связи в сахарофосфатном остове позволяет двум отрезкам спирали ДНК по обе стороны надреза свободно вращаться друг относительно друга, используя фосфодиэфирную связь в противо Рис.$.21.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
