Б. Альбертс, А. Джонсон, Д. Льюис и др. - Молекулярная биология клетки (djvu) (1129766), страница 83
Текст из файла (страница 83)
Структура репликационной вилки ДНК. Поскольку обе цепи дочерней ДНК полимеризуются в направлении б' -+ 3', ДНК, синтезируемая на отстающей нити, должна изначально синтезироваться в виде ряда коротких молекул ДНК, названных фрагменпгамо Окозако. Фрагменты Оказаки синтезиру- ются на отстающей нити последовательно„при зтом чем они ближе к вилке, тем «новее».
Например, с маленькими изменениями в геометрии спирали между О и Т в ДНК могут образовываться две водородные связи. Кроме того, кратковременно возникают редкие таутомерные формы четырех оснований ДНК в отношении 1 на !Оз или !О'. Такие формы ошибочно образуют пару, не нарушая при этом геометрии спирали: например, редкая таутомерпая форма С спаривается не с О, а с Л. Если бы ДН К полимераза не предпринимала никаких специальных действий, когда происходит ошигючное спаривание между прибывшим дезоксирибонуклео зидтрифосфатом и матрицей ДНК, то в новую цепь ДНК зачастую включался бы неправильный нуклеотид, что приводило бы к частому возникновению мутаций.
Однако высокая точность репликации ДНК зависит ие только от изначального спаривания оснований, но также и от нескольких «корректирующих» механизмов, которые последовательно работают над исправлением ошибочных пар, периодически возникающих в новом поколении ДНК. Первый этап коррекции ДНК полимераза выполняет непосредственно перед тем, как новый пуклеотид присоединяется к наращиваемой цепи. Наши знания об этом механизме получены в ходе исследований нескольких различных ДНК полимераз, а в их числе и одной производимой бактериальным вирусом Т7, который реплициру ется в Е. со1т. Нужный нуклеотид имеет более высокое сродство к движущейся по лимеразе, чем неверно выбранный, потому что правильное спаривание благоприятнее в энергетическом отношении. Г»олее того, после связывания нуклеотида, но прежде чем нуклеотид ковалентно присоединится к растушей цепи, фермент должен претерпеть конформационное изменение, в результате которого его «пальцы» сжимаются вокруг активного участка (см.
рис. 5А). Поскольку такое изменение легче происходит при правильном, чем при неправильном спариванни основанитц это позволяет полимеразе выгюлнять «двойную проверку» точной геометрии пары оснований, прежде чем она решится катализировать присоединение нуклеотида к цепи. Следуюшая исправляющая ошибки реакция, известная как экзотпуклеолити ческая коррекцгся (ехоппс!ео!уйс ргоо1геас(!пя), имеет место незамедлительно после тех редких случаев, когда неверный нуклеотид все-таки ковалентно присоединяется к растущей цепи. Ферменты ДНК. полимеразы являются чрезвычайно разборчивыми в отношении типов цепей ДНК, которые они удлиняют: они безапелляционно требуют заранее сформированного, спаренного с матрицей 3'-ОН-конца затривочной цели, или праимера (рбтпег зсгапс(; см. рис.
5. 4). Те молекулы ДНК, что несут некомпле ментарный (ошибочно спаренный) нуклеотид на 3'-ОН-конце затравочной цепи, не ночная з' з' 5' 5' ичнвя Рис. 5 9. Редактирование(ейМпв) репликацииДНК-полимераэой. Общая схема структуры ДНК-полимеразы в номплексе с матрицей ДНК: в режиме полимериэации (слева) и в режиме редактирования, или коррекции (справа). Обозначены каталитические сайты для экзонуклеолнтической реанции (с) и реакции полимеризации (Р). 8 режиме редактирования новосинтезированная ДНК кратковременно отходит от матрицы и полимераза претерпевает конформационнов изменение, в результате которого корректирующий каталитический учасюк занимает другое положение, где и происходит удаление последнего из присоединенных нуклеотидов.
Таблица 5.1. Три этапа, обеспечивающих высокую точность синтеза ДНК Зкзрнуюгеояитическйв коррекцияв направлении 3':-.ь $' Нанравляемве нетью исправление ошибок.ртариван(»я 1' иа.1бэ . ' чз Н51бэ Примечание трглий мэп нзгггравяяеное пенью исправление ощиГюк сгырнвзння ююсэн ниже в этой главе. 5.2.4. Эффективное исправление ошибок возможно лишь лри релликации ДНК в направлении 5' -+ 3' Причина, по которой рспликация ДНК происходит исключительно в на правлении 5' -+ 3', объясняется, вероятно, необходимостью получения на выходе «качественного продукта».
Если бы существовала ДНК полимераза, которая при соединяла бы дезоксирибонуклеозидтрифосфаты в направлении 3' з 5', то активи генов, не нуждаются в таком эффективном экзопуклеолитическом корректируюгцем механизме: ошибки, возникающие при создании РНК, не передаются следующему гюколению, и случайная дефектная молекула РНК, которая произведена, не имеет никакого значения в долгосрочной перспективе. 1!оэтому Р11К полимеразы способны начинать синтез новых полинуклеотидных цепей без затравки.
Как в процессе синтеза РНК, так и в самостоятельном процессе — трансляции последовательностей мРНК в последовательности белков — частота появления ошибок составляет около одной ошибки на каждые 10» событий полимеризации. Такой коэффициент ошибок в 100000 раз больше, чем при реплнкации ДНК, в ка ковом случае ряд корректирующих процессов обеспечивает необычайгнунз точность работы !Таблица 5.1). руюший трифгзсфат, необходимый для образования ковалеьп ной связи, обеспечивал бы наращиваемый 5' конец цепи, а не присоединяемый мононуклеотид.
В таком случае ошибки полимеризации попросту не могли бы исправляться гидролизом, потому что голый 5' конец цепи, созданный таким образом, немедленно завершил бы синтез Д)-)К (рггс. 5.)0). Поэтому исправить несоответствуюшее основание аатравочная цепь б' 4~-';"~агпостутающии правильный деаоксирибонукпеотид- трифосфат поступающи дезоксири6 три фосфат РАСЩЕПЛЕНИЕ МАКРОЗРГИЧЕСКОЙ СВЯЗИ ДАЕТ ЭНЕРГИК) ДЛЙ ПОЛИМЕРИЗАЦИИ РЕАКЦИЯ НЕ ПРОДОЛЖАЕТСЯ.' ТАК КАК НЕТ РАСЩЕПЛЕНИЙ ыдкРОЭРГИческО))) сВЙзи Рис.5.10.
Объяснение факта наращивания цепи ДНК в направлении 5' -+ 3'. Рост в направлении 5' — + 3', представленный справа, позволяет цепи продолжать расти, после того как ошибка в полимеризации удалена зкзонуклеолитической коррекцией (см рис. 5.8) Напротив, зкзонуклеолитическая коррекция в гипотетической схеме полимеризации в направлении 3' — + 5', помещенной слева, блокировала бы дальнейшее удлинение цепи. Для удобства показана только затравочная нить двойной спирали ДНК если при коррекции б' будет удален нукпеотид, то получается бсконец если при коррекции будет удален нуклвотид, то получается Зсконец Рис.
5. 12. Синтез одного из многочисленных фраг- ментов ДНК на отстающей цепи. В клетках эукариот РНК-затравки синтезируются на отстающей цепи с промежутками, разделенными приблизительно 200 нуклеотидами, и каждая РНК-затравка имеет длину около 10 нуклеотидов. Такая затравка вычищается специальным ферментом репарации ДНК (РНКазой Н), который распознает нить РНК в спирали РНК -ДНК н фра гментирует ее; после этого остаются бреши (Вара), которые заполняются с помощью ДНК- полимерззы и ДНК-лигазы. синтез новои РНК-затравки, катализируемый ДНК-праймазой 3' 4(зев 5' РНК- затравка з « 5' ДНК-полимераза присоединяет нуклеотиды к новой РНК-затравке, начиная тем самым синтез нового фрагмента Окаэаки матрица цепи 3' б' ДНК-полимераза завершает синтез фрагмента ДНК образом, синтез РНК затравок направ ляется по тому же матричному принципу тпо шаблону), что используется для син 51 теза ДНК.
Поскольку РНК затравка со держит должным образом спаренный ком плементарный нуклеотнд с группой 3' О(( на одном из концов, то он может быть про должен Д((К-полимеразой с этого конца старая РНК-затравка удаляется; вв заменяет ДНК и дать тем самым начало фрагменту Ока заки. Синтез каждого фрагмента Оказаки заканчивается, когда Д((К полимераза на тыкается на РНК затравку, находящуюся на 5'-конце предыдущего фрагмента. Для того чтобы собрать непрерывную цепь ~т 5' 3' | ДНК-пигаза сшивает разрыв: новый фрагмент Окаэаки присоединяется к растущей цепи 3' 5' ДНК из многочисленных фрагментов ДНК, синтезируемых на отстающей нити, на выручку быстро приходит специальная система репарации ДНК вЂ” она вычищает старую Р1(К затравку и заменяет ее по следовательностью ДНК. После этого фермент, называемый ДНК-лигазой, сводит воедино 3'-конец нового фрагмента ДНК с 5' концом предыдущего н завершает этим актом весь процесс (рнс.
5.12 и 5.13). По какой же причине недолговечной РНК затравке могло быть отдано вредно чтение перед ДНК затравкой, которую не было бы надобности удалять? Тот факт, высеобс»кдвнив использование Рис. 5.13. Реакция, катализируемая ДНК-лягавой. Этот фермент «сшивает» разрыв фосфодиэфирной связи. Как показано нз схеме, ДНК-лигаза использует молекулу АТР„чтобы активировэть Бьконец в разрыве (шэг 1) перед образованием новой связи (шаг 2) Благодаря этому энергетически невыгодная реакция «сшивания» разрыва осуществляется за счет сопряжения с энергетически благоприятным процессом гидролиза АТР 5.2.6. Рпсппптпть ДвОЙмузо спмрппгз ДНК пврпД РпппмкпцмпнмОЙ пмпкОЙ помогпмгт сппцмппьмьгв бппкм Ддя планомерного протекания синтеза ДНК двойная спираль ДНК перед репли кационной вилкой должна быть расплетена, с тем чтобы дезоксирибонуклеозидтри фосфаты могли образовывать пары оснований с матричной нитью.
Однако двойная спираль ДПК очень устойчива в физиологических условиях; пары оснований закреплены на своих местах столь прочно, что необходимы температуры, близкие к точке кипения воды, чтобы разделить две комплементарные цепи в условиях кч оЫго. Поэтому, чтобы двойная спираль раскрылась и одноцепочечная Д11К стала доступной для копирования ДНК.полимеразой, необходимы особые белки. Они бывают двух типов: ДНК хеликазы и белки, связывающие одноцепочечную ДНК.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
