Б. Альбертс, А. Джонсон, Д. Льюис и др. - Молекулярная биология клетки (djvu) (1129766), страница 86
Текст из файла (страница 86)
Проблема закручивания ДНК, которая возникает в ходе репликвции. У бвктерий для продвижения реплика цион ной вилки со скоростью »00 нуклеотидав в секунду материнская спираль ДНК перед этой вилкой далина врвсцаться с частотой бо оборотов в секунду. вться положной надрезу нити в качестве шар пира для вращения (рис.
5.22). Любое напряжение в спирали ДНК будет осу натри ществлять такое вращение в направле ведущв нии, снижающем это напряжение. В ре Ц зультате рспликация ДНК может идти своим чередом при вращении только короткого отрезка спирали —. части, ле жащей сразу перед вилкой. Поскольку ковалентная связь, которая соединяет б) белок ДН К топоизомеразу с фосфатом в цепи ДНК, сохраняет в себе энергию рас~ цепленной фосфодизфнрной свя ш, ее лигирование (т.е. реакция «сшнва ния») происходит быстро и не требует дополнительной энергетической под питки.
В данном отношении этот механизм воссоединения фосфодизфирной связи отличается от катализируемого ферментом ДНК лигазой, о котором мы говорили раньше (см. рис. 5.13). ДНК топоизомераза второго типа, топоизомераза П, образует ковалент ную связь одновременно с обеими цепями спирали ДНК, производя временный двухцетточечный разрыв в спирали. Эти ферменты активируюгся на хромосомах в участках, где две двойные спирали пересекают друг друга. Как только молекула топоизомеразы П связывается с таким участком пересечения, она тут же использует гидролиз АТР, чтобы эффективно выполнить следую~ций набор реакпий: 1) абра тимо разорвать одну двойную спираль, чтобы создать в ней «ворота»; 2) заставить вторую, близлежащую, двойную спираль пройти через эти «ворота» и 3) после этого запечатать разрыв («закрыть ворота») и отделиться от ДН К (рис.
5.23). Таким вот образом Д1!К топоизомеразы типа П могут эффективно разделять два сцепленных кольца ДНК (рпс. 5.24). Та же реакция предотвращает также серьезные проблемы спутывания ДНК, которые в противном случае возникали бы в ходе репликации Д1! К. Эту функцию прекрасно иллюстрируют мутантные клетки дрожжей, которые производят вместо нормальной топоизомеразы П вариант, который ипактивируется при температуре вьппе 37 'С. Когда мутантные клетки нагревают до этой температуры, их дочерние хромосомы остаются переплетенными после репликации ДПК и не могут отде литься одна от другой. Огромную пользу топоизомеразы П как инструмента для распутывания хромосом сможет в полной мере оценить лишь тот, кому хоть раз приходилось биться над неожиданно объявившейся на рыболовной леске «бородой», пе имея ножниц под рукой. один конец двойной спирали ДНК не способен вращаться относительно другого ее конца б' ДНК-топоиэомераэа ! тирозином е активном К-топоиэомераза образует аалентнуто связь с одной из фосфатных групп ДНК; при этом одной цепи ДНК разрывается сфодизфирная связь теперь дэа конца двойной спирали ДНК могут вращаться относительно С г друг друга, ослабляя тем самым накапливающееся напряжение ОН энерпгя, сохранявшаяся ранее в фосфодиэфирной связи, сохраняется теперь а связи тирозин — фосфат, ф что делает реакцию обратимой 4Н спонтанное еосстаноеление фосфодиэфирной связи; при этом регенирируется и спираль ДНК, и ДНК-топоизомера: Рис.
$.22. Обратимая реакция надрезания ДНК, каталиэируемая ферментом ДНК-топоизомеразой! эукариот. Как показано, зти ферменты на короткий момент образуют одну единственную ковалентную связь с ДНК; благодаря этому становится возможным свободное вращение ДНК вокруг коаэлентных сеязей сахарофосфатного астозз, сцепленного с синим фосфатом. двойная АТРвзный домен спираль ДНК 1 топоизомервзы Г устраня разрыва в спирали 2; высвобождение спирали 1 спирали 1 через разрыв в спирали 2 и димеризация АТРэзных доменов; двухцепочечный разрыв в спирали 2 двойная спираль ДНК 1 Рис.
9.23. Модель механизма действия топоизомервзы В. Кэк показана нэ схеме, связывание АТР с двумя АТРэзными доменами вызывает их димеризэцию и обеспечивает протекание представленных реакций. Поскольку один цикл этой реакции может произойти е присутствии негидролизуемого аналоге АТР, то гидролиз АТР, кэк думают, необходим только для перезарядки фермента в каждом новом цикле реакции. Зтз модель основана нэ данных структурного анализа фермента в сочетании с результатами биохимических экспериментов.
!переработано из 2 м. вегвег, согг. Орах 5тгнсг. вюl 8: 26-32, 1998. С любезного разрешения издательстве Евевег,) 5.2Л1 1. Реппикация ДНК у эукариот и бактерий в основе своей схожа Львиная доля наших познаний о реплпкации ДНК изначально получена в ходе исследований, проведенных на выделенных из бактерий и бактериофа гов очищенных мультиферментных системах, способных реплицировать 11НК тп птгго.
Развитие таких систем в 1970 е гг. во многом обязано предшествующим исследованиям по выделению мутантов из огромного разнообразия отвечающих за репликацию генов; такие мутанты использовались для идентификации и очистки соответствующих репликационных белков. 11ервая система репликации у млекопи тающих, которая в точности реплицнровала ДНК гп п11го, была описана в середине 1980 х гг., а мутации в генах, кодирующих почти все компоненты репликационггой системы, к настоящему времени вьгделены и проанализированы у дрожжей эас сйиготусез сегепизае.
В результате многое стало известно о тонких особенностях репликацни ДНК у эукариот, и теперь ясно, что фундаментальные особенности репликации ДНК вЂ” геометрия репликацнонпой вилки и использование мульти ферментной белковой ренликационной машины — оставались консервативными на всем протяжении долгого эволюционного процесса, который разделил бактерий н эукариот. В репликационных машинах эукариот больше белковых компонентов, чем в их аналогах у бактерий, даже при том что основные функции у них одни и те же. Так, например, у эукариот белок, связывающий одноцепочечную ДНК (ВВВ белок) образован нз трех субъединиц, тогда как у бактерий в этом белке— только одна субъединица. Точно так же ДНК праймаза эукариот входит в много субьединичный фермент, который содержит также 11НК полимеразу и называется ДНК-полимеразой а праймазой.
Этот белковый комплекс начинает каждый фраг мент Окззаки на отстактщей нити с РНК затравки и затем продолжает РНК затравку коротким отрезком ДНК. В этой точке в игру входят две главные репликационные Рис. 524. Процессразделениядвухкольцввыхмолекул ДНК, катализирувмый ДНК-топоизомвраэой П. Для распутывзниясвоейДНК клвткиприбегзютклюбым ухищрениям. В отличие оттопоизомераз типа 1, ферменты типа П используют гидролиз АТР а некоторые бактериальные варианты могут создавать дополнительное напряжение в ДНК. Сфера действия топоизомерэз типа П в основном ограничена растущими клетками зукзриот; отчасти по этой причине они стали популярными мишенями прн разработке противорзковых препаратов. двв сцсппвнныв кспьцввыв двойныо спирали ДНК топоизомвразв П ДНК-топоизомврвза П обратимо присоединяется с помощью коввлвнтных свяэвй к обеим цепям ДНК-дуппвкса, Раэрывавт орвюкввую двойную спираль полимеразы эукариот, Ь и е, и довершают все фрагменты Оказаки, вместе с тем прод левая и лидирующую нить.
Как в точности задачи синтеза опережающей и отстагггщей топо р ыв «а» нити распределяются между этими двумя раскрываются, пропуская ДНК-гюлимеразами, еще не понятно вторую спираль ДНК, Как мы увидим в следующем пара. и снова закрываются графе, репликационные машины эукариот должны справляться с дополнительной трудностью — это репликация ДНК на ну клеосомах — повторяющихся структурных обратная рввкция единицах хромосом, о которых мы говори ~миг топоизомвразы— ли в главе 4. Нуклеосомы расположены на коввпвнтного присоединения— ДНК с промежутками примерно в 200 пвр 41Ягь восстанавливает нуклеотидов, чем можно объяснить, по чему у эукариот новые фрапченты Ока двойной спирали заки синтезируются на отстающей нити с интервалами в 100-200 нуклеотидов, а не в 1000 †20 нуклеотидов, как у бак двв копьцввыв двсйныв терий.
Нуклеосомы могут также служить спирали ДНК разьвдинились барьерами, которые замедляют движение молекул ДНК полимеразы, и эго может быть причиной того, что у эукариот репликационные вилки перемещаются со ско ростью, составляющей приблизительно лишь одну десятую скорости бактериальных репликационных вилок. Знкпизчянне Репликация ДНК происходит в У образнои структуре, получившей назва ние репликационной вилки. г2»ермент самокорректирующаяся ДНК полимераза катализирует полимеризацию нуклеотидов в направленгш 5' -+ 3', копируя ма тричную цепь ДНК с поразительной точностью. Поскольку две цепи двоггной спирали ДНК антипараллельны, синтез ДНК в направлении 5' -+ 3' может происходить непрерывно гполько на одной из цепей репликационной вилки (на ведущей, или опережающей, цепи).
На отстающей (или запаздывающегг1 цепи синтезируются короткие фрагменгпы ДИК по типу ° обратных стежков». Поскольку самокорректирующаяся ДИК полимераза не способна начинать новую 5.3. Запуск и завершение репяикацин ДНК в хромосомах 431 цепь, для синтеза фрагментов ДНК на отстающей цепи сначала синтезиру ются короткие молекулы РНК-затравок, которые впоследствии вычищаются и заменяются на ДНК. Для репликации ДНК необходи,ча согласованная работа многих белков. К ним относятся: 1,) ДНК-полимераза и ДНК-праймаза, необходимые для катализа полимеризации нуклеозидтрифосфатов; 2) ДНК-хеликазы и белки, связывающие одноцепочечную ДНК 155В-белки), помогающие расплести спираль ДНК вЂ” чтобы она могла быть скопирована; 3) ДНК лигаза и фермент, кото. рому «поручена» деградация РНК-затравох, — чтобы сшивать дискретно синтезируе чые фрагменты ДНК на отстающей нити; и 4) ДНК-топоизомеразы, призваннсче помочь разрешить проблемы закрученности спирали и спутывания ДНК. Многие из этих белков связаны друг с другом в репликационной вилке и образуют очень эффективную «репликационную машину», через которую согласуются действия и перемещения отдельных компонентов в прострап.
стве. 5.3. Запуск и завершение репликации ДНК в хромосомах Мы познакомились с тем, как набор репликационных белков быстро и точно производит две дочерние двойные спирали ДНК позади репликационной вилки. Но как все эти репликационные машины собираются с самого начала и как репли кационные вилки создаются на молекуле двухцепочечной ДНК? В этом параграфе мы обсуждаем, как клетки запускают (инициируют) репликацию ДНК и как они тщательно регулируют этот процесс, чтобы гарантировать его протекание не только в надлежащих позициях на хромосоме, но также и в должные периоды жизни клетки.
Мы обсуждаем также несколько специальных проблем, которые репликационным машинам приходится преодолевать в клетках эукариот. В их числе необходимость реплицировать чрезвычайно длинные молекулы ДНК в хромосомах эукариот, равно как и сложность копирования молекул ДНК, которые связаны в тесные комплексы с гистонами в нуклеосомах. 5.3.1. Синтез ДНК начинается а точках начала репликации Как сказано ранее, двойная спираль ДНК обычно очень стабильна: две цепи ДНК накрепко сцеплены друг с другом многочисленными водородными связями, образованными между основаниями обеих цепей. Чтобы быть использованной в качестве матрицы, двойная спираль должна быть расплетена и обе цепи отделены одна от другой, с тем чтобы неспаренные основания оказались снаружи.
Как мы увидим, процесс репликации ДНК начинается специальными инициаторными белками (1п111а1ог рго1егпз), которые связываются с двухцепочечной ДНК и раз деляют две нити, разрывая водородные связи между основаниями. Позиции, в которых спираль ДН К изначально раскрывается, называют точками начала репликации (гер!)са1)оп ог)я)п; рпс. 5.25).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
