Биохимия 1 (1984) (1128709), страница 43
Текст из файла (страница 43)
В механизме образования упомянутого промежуточного соединения важную роль играет также перенос протона от серина-195 на гистидин-57 (рис. 8.18). Перенос протона значительно облегчается благодаря присутствию системы переноса заряда. Аспартаз-102 строго ориентирует положение имидазольного кольца гистидина-57 и частично нейтрализует заряд, появляющийся нл этом кольце в момент переходного состояния.
Протон, накопленный парой гистндин — аспартат, переходит далее к атому азота гндролизуе- Непопярнмй карман Схематическое изображение присоединения к химотрипсину формил-).-триптофана (аналог субстрата). Рвс. 8.16. Зег 195 Осн. цепь,, Снг ггч 195 Н к а Рис. 8.17. Тегрвэдрическое промежуточное соединение в реакциях ацилирования и деацнлирования химотрипсина.
Стабильность промежуточного соединения обеспечивают водородные связи, образованные ХН-группами основной цепи фермента. Этот участок называется полостью оксиаяиояа. 159 8. Антавацвж нроферментов мой пептидной связи, которая в результате разрывается, На этом этапе аминный компонент субстрата оказывается соединенным волородной связью с гистидином-57, а кислотный компонент — эфирной связью с серином-!95. На этом завершается стадия ацилировония гидролитической реакции. Следуюшая стадия — двацилироваяив (рис. 8.19).
Аминный компонент субстрата диффундирует прочь от фермента, а на его место в активном дентре встает молекула Тетреедрнчесхое дцнн-фернент переходное состоннне !пдонежуточный продукт) Субстрат 0 ть й' — сн,— о й' о=с й — Н вЂ” Н -о, с — сн — о' й — Н вЂ” Н вот 199 — сн,— о Н й — Н вЂ” Н Н СН !Ч -СН Н Н СН НС и — С Н СНг О С НС И- С Н-. С Н Н~х 57: СН, О чь) днв 102 С Н СН, о Ъ, С Рис. 8.18. Первый этап гидролиза пептидов химотрипсином †ацилирование.
Образуется тетраэдрическое промежуточное соединение. Затем аминный компонент субстрата быстро отделяется от фермента, а фермент превращается в ацил— фермент — промежуточный продукт катализа. воды. По сути деацилирование — это процесс, обратный ацилированию, нос заменой амин- ного компонента субстрата на //гО. Сначала система переноса заряда отрывает протон от воды. Образующийся ОН -ион немедленно атакует карбонильный атом углерода ацильной группы, присоединенной к серину-195. Как и при ацилировании, формируется тетраэдрическое промежуточное соединение.
Далее гистидин-57 передает протон на атом кислорода серина-195, что приводит к высвобождению кислотного компонента субстрата. Этот компонент отделяется путем диффузии от фермента, который может вступить в новый каталитический цикл. 8ЛО. Механизм активации профермента Обратимся теперь к вопросу о том, каким образом расщепление всего одной пептидной связи в химотрипсиногене превращает его в активный фермент. Трехмерную структуру химотрипсиногема исследовал Джозеф Краут (/.
Кгащ), установивший, что в про- Часть 1 160 Конформации и динамика цессе активации фермента его конформация притерпевает ряд изменений. 1. Гидролиз пептидной связи между аргинином-15 и изолейцином-16 создает новые С- и )ч)-концевые группы. 2. Вновь образованная /чконцевая группа изолейцина-/6 загибается внутрь и взаимодействует г агпиртато.и-/94 внутри молекулы химотрипсина (рис. 8.20). Протонирование этой аминогруппы стабилизирует активную форму химотрипсина, о чем свидетельствует характер зависимости ферментативной активности от рН. 3. Это электростатическое взаимодействие между положительно заряженной аминогруппой и отрицательно заряженным карбоксилат-ионом, происходящее в неполярной области фермента, запускает рял конформационных сдвигов.
Метионин-192 из глубины молекулы перемещается ближе к поверхности,а остатки 187 и !93 становятся более вытянутыми. В результате образуется субстрат-специфичный участок лля ароматических и больших неполярных групп. Одну сторону этого участка составляют остатки от!89 до !92. В проферменте эта полость для гвязывиния чисти субстрата сформирована не полностью. 4. Тетраэдрическое переходное состояние, возникающее при катализе химотрипсином, стабилизируется водородными связями между отрицательно заряженным атомом кислорола карбоксильной группы и лвумя НН-группами самой полипептидной цепи (рис. 8,17).
В химотрипсиногене одна из этих ХН-групп расположена так, что недоступна для связывания. Следовательно, в зимогене и полость оксианиона до конца не сформирована. данн -ферттент (проттектуточный продукт) о й' — сн — о-- с тетраадрнческое переходное состоннна о ц — Сн,— О дискетный компонент суострата ц' — СН,— 0 0=-С н нс с Н сн, н сн нс н -сн нс' ы -с н Снт с Н16 Ву 0 с н сн о 1б1 11-665 О О о А р )па С с Рис, 8.19. Второй этап гидролиза пептида химотрипсином — деацилиравание.
Ацил — фермент (промежуточный продукт) гнлролизуется водой. Деацилирование по существу представляет собой реакцию, обратную ацилированию, но на место амин- ного компонента субстрата от~но~нтск Н,О. 5. Конформационные сдвиги в остальных частях молекулы очень незначительны. Таким образом, нвключение» 95ерл1ентативнай активности в белке осуществляется путем отдельных, строго локализованных канфармационных сдвигов, запускаемых гидрализам всего лишь одной пептиднай связи. 8.11. Тринсии и эластаза: вариации на тему Трипсин и эластаза сходны с химотрнпсином во многих отношениях.
!. Все три фермента секретнруются поджелудочной железой в виде проферментов и активируются путем расшепления одной- единственной пептидной связи. Возникаю)цая при этом конпевая аминогруппа загибается внутрь молекулы и электростатнческн связывается с карбоксилат-ионом аспартата-194.
2. Последовательность расположения около 40% аминокислот в этих трех ферментах идентична. Для аминокислотных остатков, локализованных во внутренней части молекулы, степень идентичности еше выше. 3. Фторофосфаты, в частности ДИФФ, нгнибируют все три фермента. Подобно химотрипсину, и трипсин, и эластаза содержат в активном центре остаток серина. Более того, во всех трех ферментах одинакова после- довательность амююкислот, окружающих серии: С!у-Авр-Бег-О!у-О1у-рго. 4.
При рентгеноструктурном анализе было выявлено большое сходство третнчной структуры этих трех ферментов (рис. 8.21). В эластазе и трнпсине, как и в химотрипсине, имеется система переноса заряда, а также полость оксианиона. 5. Механизм каталитического действия всех трех ферментов почти одинаков. Их эффективность в качестве катализаторов обеспечивается тем, что они стабилизируют переходное состояние реакции. Полость оксианнона и система переноса заряда — это те существенно важные структурные элементы каждого из ферментов, которые способствуют образованию тетраэдрического промежуточного соединения.
Будучи сходными по структуре и механизму действия, эти ферменты поразительным образом различаются по специфичности. Субстрат химотрипсина должен иметь ароматическую нли большую неполярную боковую цепь. Для трнпсина требуется субстрат, содержащий лизин или аргинин. Ни один из этих субстратов не пригоден для эластазы, проявляющей специфичность в отношении неболыпих незарюкенных боковых цепей.
Как показал рентгеноструктурный анализ, эта разница в специфичности рассматриваемых ферментов обусловлена очень небольшими структурными различнямн участков связывания субстрата (рнс. 8.22). В химотрипсине ароматические 8. Активация профермеитов Авр-1 О Яем!95 О!у-1 93 щие карман в химотрипсине, в эластазе заменены остатками валина и треонина, имеющими значительно большие размеры. Струк гурные изменения, происходящие при активации трипсиногена, несколько отличаются от изменений, связанных с активацией химотрипсиногена. Рентгеноструктурные исследования, проведенные независимо Робертом Хьюбером и Робертом Строудом (К. НцЬег, К.
81гонб), показали, что при активации трипснногена происходят значительные изменения конформации четырех протяженных отрезков полипептида, составляющих примерно 15, молекулы. Эти области, названные доченцчи активации, не имеют устойчивой структуры в пуафер.ченте. но приобретиют строго определенную конфорчацию в трипсине. Кроме того, полость оксианиона в трипсиногене расположена слишком далеко от гистн. лина-57 и поэтому не может способствоватг образованию тетраздрического промежу. точного соединения. Рис.
8.20. Окружение аспартата-194 и нзолейцина-16 в химотрипсине. Электростатическое взаимодействие между карбоксилат-ионом Авр-194 (красный) и и-)х(Нз-группой 1!е-16 (синяя) играет важную роль в каталитической активности химотрипсина. Эти группы расположены в непосредственной близости к системс переноса заряда. 1В!озв П.М., 81е!1х Т; А., Х-гау б!((гас!!оп вгцб!ев о( епхуппз, Апп. Кем Вюсйегп., 30, 86 (1970).~ н большие неполярные боковые цепи субстрата размещаются в неполярном кармане. В трипсине имеется такой же карман, отличающийся, однако, от неполярного кармана химотрипсина заменой одного остатка— вместо серина стоит аспартат.
Этот аспартат в неполярном кармане трипсина образует прочную электростатическую связь с положительно зарюкенными боковыми цепями лизина или аргинина субстрата. В эластазе же нет такого кармана для субстрата, поскольку два остатка глицина, выстилаю- Часть 1 162 Конфврмацвя н динамика 8.12. Ингнбитор панкреатического трнпсина прочно связывается в активном центре тряпкина Регуляция активности панкреатических протеиназ осуществляется двумя различными путями. Первый — превращение профермента в активную протеиназу путем расщепления одной пептидной связи. Это очень точный механизм ивключенияп ферментативной активности, однако он необратим„н, следовательно, для остановки протеолиза должен существовать второй регуляторный механизм. Эту функцию выполняют специфические ингибиторы протеиназ.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
