Биохимия 1 (1984) (1128709), страница 38
Текст из файла (страница 38)
Дру~ое подтверждение было получено при изучении аналога переходного состояния субстрата„ т.е. соединения, имеюшего как до, так и после связывания с ферментом такую же геометрию, как субстрат в переходном состоянии. Кольцо Р лактонного аналога тетра-ХАО (рис. 7.19) в кристалле тетрасахарида имеет конформацию полукресла. Прн связывании с лизоцимом атомы С-1, С-2, С-4, С-6 и кислородный атом кольца Р этого аналога располагаются в одной плоскости. Такая конформация «софы» сходна с постулированной для переходного состояния конформацией полукресла; это означает, что лактонный аналог в отличие от тетра-ХАО при связывании с лизоцимом деформируется очень мало. Оказалось, что лактонный аналог связывается с лизоцимом (в участках связывания от А до Р) в 3600 раз сильнее, чем тетра-ХАО.
Отсюда вытекает, что при деформации кольца В нормального субстрата скорость расьцепления может возрасти примерно в 3600 раз. Роль этого фактора в катализе ясно предвидел Полинг (Рап!шй), о чем свидетель- +но — > + Гекса-ХАО гидролизуется с образованием тетра-ХАО и ди-ХАО. х с о тк й й тэ к о я е 4 тэ ст 2 Рис.
7.28. к 6 О .т о е -2 о о — 4 Рис. 7.18. 143 ствует его лекция, читанная в 1948 гл «Я полагаю, что ферменты-это молекулы, которые по структуре комплементарны активированным комплексам тех реакций, которые они катализируют, т.е. молекулярной структуре, промежуточной между реагирующими веществами и продуктами реакции в данном каталитическом процессе. Сила притяжения молекулы фермента к активированному комплексу приводит к снижению энергии последнего, а следовательно, к снижению энергии активации данной реакции и возрастанию скорости реакции». 4. Зилисимость скорости коталитической реакции оят рН.
Скорость гидролиза хитина достигает наиболее высоких значений при рН 5 (рис. 7.20). По обе стороны от этого оптимума ферментативная активность резко падает. Снижение активности при сдвиге рН в щелочную сторону обусловлено иониэацией глутамата-35, тогда как при сдвиге рН в кислую сторону — протонированием аспартата-52. Лизоцим проявляет ферментативную активность только при условии, что глутамат-35 находится в неионизированной Вклад каждого из шести угле- водных остатков гекса-ХАО в стандартную свободную энергию связывания этого субстрата. Связывание остатка 13 идеи с лоптреблеттием энергии.
Энергия расходуется на такое изменение формы остатка, чтобы он соответствовал активному центру фермента. сн,он сн,он Нхат' 'С вЂ” С НАС, С вЂ” С ННСОСН, ннсосн кареоеееаее араеаеояеаа яактеекые ееаеет тетра йАВ тетр .Ила Рис. 7.19. Кольцо 13 лактонного аналога тетра-ХАО имеет конформацию, похожую на полукресло, и в этом отношении сходно с промежуточным переходным состоянием в реакции, катализируемой лизоцимом. 4 8 8 10 рн Скорость гидролиза хитина (ро!у-ХАО) лизоцимом как функция рН.
форме, а аспартат-52-в ионизированной. 5. Избирательная химическая модификация. Лизоцим сохраняет ферментативную активность, если все имеющиеся в нем карбоксильные группы, за исключением карбоксильных групп глутамата-35 и аспартата-52, подвергнуть этерификации. Остатки 35 и 52 остаются немодифицированными, если этерификацию проводят в присутствии субстрата.
При удалении субстрата аспартат-52 этерифицируется (тогда как глутамат-35 остается неизменным). Модификация аспартата-52 приводит к полной инактивацнн фермента. Это подтверждает предположение о том, что строгая ориентация карбоксилат-нона аспартата-52 необходима для 7. Механизм дейсгвия ферментов в в с л Рис. 7.21, Карбокоипептидвза А Б В Существование проттелсуточного продукта гликозил — фермент подтверждается способностью лизоцима кагализировать, хотя н медленно, реакцию трапстлнкознлирования.
ХЛО4 (показан красным) соединяется с промежуточным продуктом гликозил фермент (показан синим на рнс. Б), и в результате образуется )х(АОл. стабилизации образующегося в качестве промежуточного продукта иона карбония. 6, Трапггликози,тровапие. При добавлении к лизоцнму тетра-ХАО происхолнт мелленное образование гекса-ХАО и ди- ХАО (рис. 7.21). Существование этой реакции, называемой трансгликозилнрованием, подтвержлает наличие одного из важных элементов прелложенного механизма ферментативной реакции, а именно образования в качестве промезкуточного продукта комплекса гликозит-- ферлтент.
Н Н О Н )) ) тг — М вЂ” С вЂ” С вЂ” Н вЂ” С вЂ” С +НгО О Н Н ьн Рис. 7.22. Реакция, катализируемая кар- боксипептидазой А. Часть 1 144 Конформация н динамика При обычных гидролитических реакциях этот промежуточный продукт реагируез с ОН . При трансгликозилировании в реакции используется вторая молекула углевода: ВОН. Реакция трансгликозилирования специфична, так как акцептор связывается в участках Е и Г в щели активного центра. Более того. образующаяся глнкозидная связь имеет ))-конфигурацию, как и в субстрата.
Таким образом, эти данные полтверждают правильность предполагаемой формы промежуточного продукта катализа. 7.8. Карбокснпептцдаза А: протеолитнчеекнй фермент, содержащий цинк Перейдем теперь к карбоксипептндазе А— пищеварительному фермен гу, гилролнзующему С-концевую пептидную связь в полипептидах. Особенно легко гидролизуются пептиды, в которых С-концевой остаток имеет ароматическую нлн большую алифатическую боковую цепь (рис. 7.22). Этот фермент интересен в том отношении, что по механизму катализа он принципиально отличается от лизопима. Прежде чем перейти к подробному обсуждению механизма действия карбокснпсптидазы А, отме~ им лва основных аспекта.
!. Ипдучированное соответствие. Связывание субстрата сопровождается значительными изменениями структуры фермента. 2. Сл~еигение лтектронов. В активном центре фермента содержатся атом цинка и другие группы, которые индуцируют перераспрелеление электронов в субстрате, облегчая тем самым процесс гндролиза. Трехмерную структуру карбокснпептидазы А (рис, 7.23) цри разрешении в 2 А Н Н Н О О вЂ” Н вЂ” С вЂ” С~ + 'Н Н вЂ” С вЂ” С~ О ~, О и !во 40 20 Рис. 7.23.
Рис. 7.24. 145 Ю 655 Трехмерная структура карбоксипептидазы А. Показаны ~олько а-углеродные атомы и ион цинка (заштрихованный кружок в центре). 11!рз- сотЬ %. )ч., Ргос. КоЬегг А. %е!сЬ Гоцп5). Сопб СЬень Кез., 15, 134 (!971).~ получил в 1967 г. Уилльям Липском (%. 1)рзсотЬ). Фермент содержит одну полнпептидную цепь из 307 аминокислот, имеет компактную форму, которую можно приближенно описать как эллипсоп ~ ную с размерами 50 х 42 х 38 А. 38 А.
В ферменте -имеются области а-спиралси (38%) и !)-складчатых слоев (17;;). С белком прочно связан ион цинка, наличиекоторого необходимо для проявления ферментатнвной активности. Ион цинка расположен в углублении близко к поверхности молекулы, причем он образует координационные связи (в виде тетраэдра) с боковыми цепями двух гистидинов, боковой цепью глутамата и молекулой воды (рнс. 7.24). Рядом с ионом цинка на ферменте имеется большого размера «карман», в который попадает боковая цепь концевого остатка пептилпого субстрата. Ион цинка, расположенный в активном центре карбоксипептидазы А, образует координационные связи с боковыми цепями двух гистидинов и глутамата.
Занимающая 4-ю координационную связь молекула воды здесь не показана. (В!о5« О.М., 81е)гг Т.А., Х-гау Ййгасг)оп ззпг)!ез о! епхугпез, Апп. Кеч. В(осЬещ.. 39, 78, Сорупййг 1970 Ьу Аписа! Кет!е5кв, 1пс.) 7. Механизм действия ферментов Непепернми карман Нг 0 Нгн Н вЂ” — С НН вЂ” С вЂ” НН— ииа ' ГАщ ~ '0 ('..
Тук '248) — — .,О Н , 2 70,' — С НгС вЂ” Н 0 Н Рис. 735. Схематическое изображение связывания глнцилтирозина в активном центре карбоксипептндазы А. Показан постулированный каталитически активный комплекс. 7.9. Связывание субстрата индуцирует болььчие структурные изменения активного центра карбокснпептидазы А Представление о характере связывания субстратов с карбокснпептндазой А возникло на основе данных, полученных прн изучении структуры комплекса этого фермента с глицилтирозином. Глнцилтирозин -медленно гидролизуемый субстрат. Процесс его связывання(рис.
7.25 и 7.26) можно представить в виде пяти последовательных этапов. 1. Отрицательно заряженная концевая карбоксильная группа глицилтнрозина вступает в электростатическое взаимодействие с положительно заряженной боковой цепью аргинина-145. 2. Субстрат через боковую цепь своего тирозина связывается в неполярном кармане фермента. 3. Водород ХН-группы той пептидной Рве. 7.26.
Пространственное расположение глнцилтирозина в активном центре карбоксипептидазы А. Глицилтирознн (субстрат) изображен красным. (В!очу О.Мн Вге)гх Т.Ан Х-гау г)(йгасг)оп згпг((ез о( епхупгез, Апп. Кеч. Вюсйепзн 39, 78, Спрут(8Ь1 1970.) Часп 1 146 Квиформания и динагиика связи, которая должна гидролизоваться, соединяется водородной связью с ОН-группой ароматической боковой цепи тирозина-248.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
