Биохимия 1 (1984) (1128709), страница 42
Текст из файла (страница 42)
8.7. ном можно представить в виде слелующей схемы: Е + В = ЕЯ вЂ” ~-» Š— Рз -~-» Е Р» 2 тле Р, -аминный (или спиртовой) компонент субстрата, Š— Рт — промежуточный продукт, образованный в результате ковалентного связывания, Рт — кислотный компонент субстрата. Особенность этого механизма реакции состоит в образовании промежуточного продукта путем ковалентного связывания; в рассмотренном выше случае происходило ковалентное соединение ацетильной группы с ферментом.
В общем случае группа, присоединенная к химотрипсину на стадии Е- Р,, †э всегда ацильная группа. Таким образом, Е, — Р представляет собой промежуточное соединение ацил †ферме. 8.5. Ацильная группа соеднняетсн с необы- чайно реакционноспособным остатком серниа иа ферменте Место, в котором происходит присоедине- ОН Оепмлаланмн тмроемн трмптофап Метмонмп Химотрипсин гидролизует предпочтительно пептцдные связи, образованные карбоксильными группами ароматических аминокислот, а также аминокислот с большой неполярной боковой цепью. Часть 1 15б Конформации и динамика н с о о я х В е я я е о Ю о о о» Время после смемнеання, мс После смешивания химотрипсина и и-нитрофенилацетата можно наблюдать две фазы образования п-нитрофенола.
Промежуточнма п.Нптропроятят ацетмл — фенол фермент Ацилирование: образование комплекса ацетил †ферме в качестве промежуточного продукта. Π— » (Ферме~.~ Ч С вЂ” СН + — — з О ~ Фермент СН ОН Н Н С вЂ” С вЂ” СН з з ΠŠ— р О ) О Н С вЂ” С вЂ” СН з з Н Димтопропипфторфоофет !дИФФ1 н Н С вЂ” С вЂ” СН з ~Фермонт1 СН,О -Р=О + НЕ О нс — с — сн з з н Инеятмемроеемные феЗзмеит Рис. 8.11. Диизопропилфторфосфат (ДИФФ) инактивирует химотрипсин ну~ем образования диизопропилфосфорильного производного серина-!95. например диизопропилфторфосфатом (ДИФФ), который взаимодействует только с серином-195, давая неактивный высокостабильный комплекс диизопропилфосфорил— фермент (рис.
8.11). О повышенной реакционной способности серина-!95 отчетливо свидетельствует тот факт, что остальные 27 остатков серина в химотрипсине не взаимодействуют с ДИФФ. О )( ~Фермент~ — СНз — Π— С вЂ” СНз Серии дцетмльмея 195 труппе Химотрипсин — не единственный фермент, инактивирующийся в присутствии ДИФФ. Множество других пратеолитических ферментов, например трипсин, эластаза, тромбин, субтилизин, специфически реагируют с ДИФФ, полностью теряя при этом активность.
Как и в случае химотрипсина, реакция этих ферментов с ДИФФ идет только по одному остатку серина. Отсюда и их общее название — сериповые протеиназы. ДИФФ вступает также в реакцию с остатком серина в ацвтилхолцнэстеразе — ферменте, играющем ключевую роль в перслаче нервных импульсов в определенных синапсах. Как уже упоминалось в гл. 6, способность ДИФФ инактивировать апетилхолинэстеразу лежит в основе его использования в инсвктнцидах и нервно-пара.штических газах.
8.6. Участие гнстидина-57 в катализе выявляется с помощью аффинной метки Участие в катализе второго аминокислотного остатка было установлено путем исполь- Группа. опродопяющея специфичность Н О 1 )! СН вЂ” С вЂ” С вЂ” СН С! н — н Реакционно- И способная группа Структура тозил-1.-фенилаланинхлорметилкетона (ТФХК), используемого в качестве аффинной метки химотрипсина (К'-тозильная группа).
Рис. 8.12. 157 8. Акзивщкя профермеитов зования так называемой аффинной метки, или метки но сроДству. Метод заключается в том, что к химотрипсину добавляют вещество, которое 1) специфически связывается в активном центре в силу подобия с субстратом и затем 2) образует стабильную ковалентную связь с некоторой группой, расположенной на ферменте поблизости.
Таким веществом является тозил-Ь-фенилаланинхлорметнлкетон (ТФХК), строение которого показано на рис. 8.12. Наличие боковой цепи фенилаланина в ТФХК обеспечивает его специфическое связывание с химотрипсином. Реактивная группа ТФХК вЂ” это хлорметилкетон. ТФХК атакует химотрипсин только по гистилину-57, алкилируя один из атомов азота гистидинового кольца (рис. 8.13). ТФХК- производное химотрипсина лишено ферментативной активности.
Имеется три довода в пользу присутствия гистидина-57 в активном центре фермента. Во-первых, аффинная метка в высокой степени стереоспецифична: О-изомер ТФХК абсолютно неэффективен. Во-вторых. присутствие конкурентного ингибитора трипсина — !)-фенилпропионата — тормозит реакцию с ТФХК. В-третьих, скорость инак гивацин химотрнпсина при добавлении ТФХК находится примерно в такой же зависимости от рН, как скорость катализа. 8.7. Система переноса заряда обеспечивает челночную передачу протона прн катализе Каталитическая активность химотрипсина определяется необычайно высокой реакционноспособностью сернна-195.
В физиологических условиях — — СН ОН-группа обычно инертна. Почему же в акз ианом центре хнмотрнпсина ее реакционная способность столь резко возрастает? Объяснить это можно, исходя из результатов рентгеноструктурного исследования трехмерной структуры фермента. Как и можно было предположить еще на основе результатов введения аффннной метки, гистидин-57 расположен в непосредственной близости от серина-195. Рядом находится также карбоксильная группа боковой цепи аспартата-102 (рис. 8.14).
По существу каталитнческая способность химотрипснна обусловлена взаимодействием этих трех остатков. Аспартат-102 образует водородную связь с гистнднном-57, который в свою очередь соединен водородной связью с сернном-195. Эти три остатка создают систему переноса заряди. Как показано в разд. 8.9, эта система играет ключевую роль в катализе благодаря способности связывать протон (рис. 8.15).
Погруженный в молекулу карбоксилат-ион аспартата-! 02 поляризует имидазольную группу гистндина-57, что повышает его способность осуществлять челночную передачу пропгона. При этом аспартат-102 и гистиднн-57 расположены так, что во время нуклеофильной атаки субстрата кислородом они акцептируют протон гидроксильной группы серина-! 95. 8.8. В хнмотрнпснне имеется глубокий карман для связывания ароматической боковой цепи Локализация участков специфического связывания и вероятная ориентация гидролизуемой пептидной связи эффективного субстрата были выявлены в результате рентгеноструктурного анализа комплексов химотрипсина с аналогами субстрата.
Установлено, что формил-(.-триптофан связывается с химотрипсином через индоль- Часть 1 158 Конформации и дннавгнка СНг С (Ч тф (гг Сн~ С Н !( (~ — + — ~( нс сн нс сн Н Гпетнаан $7 5ег-195 ~Д l) 7 Нгз-57 Рнс. 8.14. Конформация системы переноса заряда в химотрипсине. (В!очч Р.М., 81е(гг Т.А., Х-гау Ййгасг)оп зщейез о( епгушез, Апп. Кеч. ВюсЬещ., 39, 86 (1 976).1 Н С вЂ” — Π— Яег 195 Н С=С Нгз 57 О Авр С О 102 Н С г' н н — (~ — бег 195 нс=с О~ Нге 57 О Азр — С вЂ” О— 102 Система переноса заряда в химотрипсиие: А — фермент без субстрата; Б-прн добавлении субстрата происходит промежуточное связывание протона аспартатом-102 и гистндином-57.
Рис. 8Л5. Рнс. 8.13. Алкилирование в химотрипсине ТФХК. сн С=О и гистидина-57 воздействием Осноанаа цепь 193 Нт 57 зек 195 Основная це 214 ную боковую цепь, которая хорошо соответствует по размеру карману на ферменте вблизи серина-195 (рнс.
8.16). Именно наличием этого глубокого кармана объясняется специфичность химотрипсина в отношении аминокислот с ароматической иди иной гилрофобной боковой цепью большого размера. При рентгеноструктурном анализе комплексов химотрипсина с аналогами полипептидных субстратов обнаружено большое число водородных связей между основными цепями фермента и субстрата, причем эти водородные связи располагаются так же, как в антипараллельных ()-складчатых слоях. 8.9. В процессе катализа образуется переходное тетраэдрическое промежуточное соединение Широкие рентгеноструктурные и химические исследования химотрипсина позволили прийти к определенному выводу относительно механизма его каталитического действия.
По-видимому, гистидин-57 и серия-195 непосредственно участвуют в расщеплении пептидной связи субстрата. Гидролиз этой связи начинается с того, что кислородный атом ОН-группы сернна-195 атакует карбоннльный атом углерода в гидролизуемой пептидной связи субстрата. В результате связь между а~омами углерода н кислорода в этой карбоннльной группе становится одинарной и атом кислорода приобретает отрицательный заряд. Четыре атома, связанные с углеродом карбонильной группы, располагаются в виде тетраэдра. Образование из плоской амидной группы этого тетраэдрического оромелсуточного соединения оказывается возможным только благодаря возникновению волородных связей между отридагсльно заряженным атомом кислорода гидроксильной группы (называемым оксиаяиояом) и двумя )ч)Н-группами самой полипептидной цепи (рис. 8.17).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
