Lenindzher Основы биохимии т.1 (1128695), страница 66
Текст из файла (страница 66)
Например, в реакции, катализируемой гексокнназой, АТР и глюкоза-это субе».раты, а АОР и глюкоза-6-фосфат — продукты: АТР + Глюкоза — АОР + + Глюкоза-б-фосфат. Для опрелеления скорости таких двухсубстратных реакций также можно использовать подход Михаэлиса — Ментен. Как мы уже видели, гексокиназа характеризуется разными значениями Км для каждого из ее двух субстратов (табл. 9-4).
Ферментативные реакции с участием двух субстратов обычно включают перенос атома или функциональной группы от одного субстрата к другому. Такие реакции могут протекать по двум различным механизмам (рис. 9-5). В реакциях первого типа, называемых реакциями единичною замещения, два субстрата А и В связываются с ферментом Е либо специфическим, либо случайным образом с образованием комплекса ЕАВ, который затем распадается на продукты С и О. Второй класс двухсубстратных реакций составляют реакции, протекающие по механизму даой»»ого замещения (механизм типа «пинг-пон»ъ). В этих реакциях Гл. 9 Ферменты 239 Рени))ил лнойио) о зпмеигпния )механизм типа пинг-поцг ') АХ+ — тА+ВХ Реакция елшгичнаго замещения А+В~с" +В АХ эА Активный: - „9' ~ ' В ' — 3' .В ' -У Й центр В'я' увх В'' ~:В' -ф В Оптимум РН Фсрмсгп Пенсии Трипсин Катализа Аргипаза Фу марези Рибонуклензв ),5 7,7 7,6 9,7 7,В Рис.
9-5. Слсмвгичсскос изобрвиснис лвуксубстрвтных рспкпий. гпиосяшикся к лвум ркзным классам. и РеакцИя слиничиого зямсшсния. В олнцз рсякцияк лаго гнпп субе грсты А и В могу~ связывнться с ферментом в любой послсловя гслыюстн. в лругнк сушссгвусг опрслслснный порялок присосли- нсння А и В. Б. Рсвкция лвойгюго звмсшсния (мсяпггвзм типа «гзинг-гзон~ з). Первый субсгркз АХ псрслвст группу Х ферменту. Затем.
восле гого ккк А вьювобоилястся. субстрв~ В (якисггтор группы Х) связыввстся с фсрмси шм. с каталитическим центром фермента в каждый момент времени связан только один из лвух субстразов. Присоединеггие первого субстрата сопровождается переносом его функциональной группы на молекулу фермента Только после улаления продукта, образовавше) ося из первого субстрата, второй субст)хгт может связаться с ферментом и принять функциональную группу.
Для каждого фермента характерна опрелеленная область оптимальных значений рН (оптимум рН), при которых он проявляет максимальную активное и, (рис. 9-6 и табл. 9-5). Форма кривых, описываинцих зависимость активности фермента от рН, отражает способность Таблица 9-5. Оптимальные значении рН лля некоторых ферментов важных для данного фермента протондонорных или протон-акцепторных г рупп в каталитическом центре фермента переходить при определенных значениях рН в состояние с требуемой степенью ионизации. Оптимум рН фермента не обязательно совпадает со значением рН, характерным для нормального внутриклеточного окружения этого фермента; последнее мажет быть как выше, так и ниже оптимума рН. Таким образом, каталитическую активность фермента в клетках можно в какой-то мере регулировать, изменяя рН окружаюшей среды.
Количество фермента в данном растворе или экстракте ткани можно определить исходя из каталитического действия этого фермента. Для этого необходимо знать: 1) суммарное уравнение катализируемой реакции, 2) какой аналитический метод наиболее пригоден для определе- ЧАСТЬ !. БИОМОЛЕКУЛЫ Относителызая скорость рН з( Относительная скорость 10 6 8 рН Б Рнс. 9-6. Кривые, харакзеризуюцше зависимость активности фермента от рН. Такие кривые строима на основе данных, полученных при измерении начальных скорссзей реакции, протекающей в буфериьп растворах с разными значеииямирН.Л. Кривая.
описывающая рН-зависимосп. активности пепсина, который гипролизует определенные пептилньж связи в белках во время их переваривания в желудке. Величина рН желудочного сока лежит межлу 1 и 2. Б. Кривая, описывающая рН-зависимость активности глнжозо-б фосфатазы из клеток печени, озвегств сапой за выделение глюкозы в кровь. В норме величина рН цнтозоля клеток печени составляет около 2,2. ния расхода субстрата или образования пролуктов реакции, 3) нуждается ли фермент в таких кофакторах, как ионы металлов или коферменты, 4) зависимость активности фермента от концентрации субстрата, т.
е, величину К м дпя данного субстрата, 5) оптимум рН фермента и 6) температурный интервал, в котором фермент стабилен и обладае~ высокой активностью. Обычно активность ферментов измеряют при оптимальном значении рН, какой-либо определенной, удобной в том или ином отношении температуре (как правило, в интервале от 25 до 38'С) и при концентрации субстрата, близкой к насыщающей. В этих условиях начальная скорость реакции обычно пропорциональна концентрации фермента, по крайней мере в заланном диапазоне концентраций фермента (рис.
9-7). Согласно международному соглашению, за единицу акгпивнпсти фермента принимается такое количество фермен= та, которое катализирует превращение 1 мимоля субстрата 11 мкмпль = 10 е моля) в 1 мин лри 25''С в аятимильных условиях действия 1Г!ермента. 30ельнай активностьюю называется число елнниц фермеитативной активности в расчете на 1 мг белка. Удельная активность-это мера чистоты ферментного препарата: она возрастает и процессе очистки фермента и становится максимальной и постоянной, когда фермент находится в чистом состоянии. Числам абпратав фермента называется число молекул субстрата, претерпевающих превращение в единицу времени в расчете на одну молекулу фермента (или один каталитический центр) в условиях, когда концентрапия фермента является единственным фактором, лимитирующим скорость реакции (табл.
9-6). Карбонат-дегндратаза (карбоангидраза) -важный фермент, присутствующий в больших концентрациях в зритроцитах,— представляет собой один из наиболее активных ферментов с числом оборотов 36000000 в 1 мин в расчете на одну молекулу фермента. Этот фермент катализирует обратимую реакцию гидрата- Таблица 9-6. Число оборотов некоторых ферментов (чнсло молекул субстрата, прегерпевающих превращение за 1 мин лри 20-38"'С) К арб оангндраза 36 000 000 Р-А л" 1 100000 1 100000 12 500 Фосфоглюкомутаза 1 240 ГЛ. 9. ФЕРМЕНТЫ 24! Ход реакции Время — ь 4 Начальная скорооггч мкмольгмин 1 8 )О 2 4 б Определение начыьноя скорости при нескольких концентрациях фермента Зависимость начальной скорость от ферментативноя актнвнсстн 5 Литва!гость фермента, единицы Б Рнс. 9-7.
Количественное определение ферментативноя активности. Зтн процедура проводится в три этапа !) определение К„ )рис. 9-4 и дополнение 9-2), 2) нзмеренке начальньж скоростей (А) при различных концентрациях фермента н при концентрации субстрата близкой к насыгпаююед, например при концентрации,равной !О.Клг, 3) построение графика Щ по оси абсциос которого откладывается концентрация фермента, а по осн ординат -начальная скорость. Используя линейную чмть кривой, можно опрелелить количество фермеята в неизвестном образце. обеспечивяюгпем дапную начальную скорость.
Вэтом примере неизвестный образец пает начальную скорость 2,5 мкмолммин и содсрхгит 5,8 единиц ферментативноя активности. ции растворенной в воде двуокиси углерода с образованием угольной кислоты (в отсутствие фермента †оче медленно протекающую реакцию) СОз + НзО НэСОз . 1 идратация СОз в зритроцитах — важный этап в процессе переноса СО, от тканей. в которых она образуется, к ле! ким„где она освобождается и выделяется в окружающую среду при выдохе (разд.
4.11. гл. 24), 9.11. Ферменты проявляют специфичность по отношению к своим субстратам Некоторые фермен гы облачают почти абсолютной специфичностью по отношению к определенным субстратам н ие взаимолействуют дьже с очень близкими по строению молекулами. Хорошим примером этого может служить фермент аспарн)аза, обиаруживаемый во многих растениях и бактериях. Ои катализирует обратимое присоединение аммиака по двойной связи фумаровой кислоты с образованием 1.-аспартата (рис. 9-8).
Однако под действием аспартазы аммиак не присоединяется ни к какой другой ненасыщенной кислоте. Аспартаза обладает также строгой специфичностью по отношению к оптическим и геометрическим изомердм: она не действует на )З-аспартат и не присоединяет аммиак к малеату-.геометрическому цггг-изомеру фумарата. С другой стороны, известны ферменты, которые проявляют относительно широкую специфичность и взаимодействуют со мно~ими веществами, имеющими общие структурные особенности.
Например, химотрипсин катализирует гидролиз многих пептидов и полипепт)щов, но разрывает только те пептидные связи, в которых карбонильная группа принадлежит остаткам фенилаланнна, тирозина нли триптофана (табл. 6-6). Несколько иная ситуация имеет место в случае кишечной фосфатазы, каталнзнруюшей гндролиз самых разных эфиров фосфорной кислоты, хотя скорости их расщепления сильно различаются. Изучение субстратной специфичности ферментов привело к возникновению идеи о комплементарности молекулы субстрата и специфического участка на поверхности молекулы фермента, которые подходят друг к другу, как ключ к замку. К этому участ- чбсть г бцемолекулы узопартаза не действует на следующие изомеры: 1.
Лспартаза СОО Н вЂ” -С вЂ” зчН~' ! СН2 ! СОО СОО НзН--С вЂ” Н СН2 СОО 1)-аспартат 1. -аспартат проверке лесятков различных синтетических субстратов выяснилось. что химотрипсин может расщеплять также простые амидные и сложно-эфирные связи. Более того, оказалось, что ароматические К-з руппы тироэина. трнп гофана и фенилаланнна, по отношению к которым химотрипсин проявляет специфичность в полнпептндах, слухсат только гидрос)юбзнымн связывающими труппами. Это подтверждается тем, что химотрипсин способен расщеплять синтетические лептиды, в которых ароматические кольца приролных аминокислот заменены на большие по размерам гидрофобные алкильные группы. Исследования субсэ ратной специфичности ферментов, а также ингибирования ферментативных реакций лают информацию о строении активных центров. 9.12.
Ферменты можно ицгибнровать определенными ХИМНЧЕСКИМЯ СОЕД2222ЕНИЯМИ действие большинства ферментов мо~но подави~~. илн ннт нбировать, определенными химическими реа|.ситами. Изучение ингибиторов ферментов позволяет получать ценные сведения о субстратной специфичности ферментов, природе функциональных групп активного центра и механизмах каталити- СОО С Н фумарат (иране-нзомер) Н --С ГОО Рис.
9-8. Реакция. ка залнзируемая аснар тзой. и субе' ра~ яая спепифияиостк фермента. Акпер тза абсоти~ ~ио спепифпкиа по отвошеизпо к фу марату а прямой реакпии и к Е-аспирину я обратной. Оиа ие атакует ии ммеат ( и»-изомер фумаратаь ии Оаспкртат. ку. называемому иитиипм.и„или ктзтплнтпчтгкп.и, ценпзрп.зз присоединяется молекула субстрата, претерпевающая превращение в холе каталитического акта. При исследовании спепифичностн ферментов выяснилось, что молекула субстрата должна обладать двумя основными структурными особенностями.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
