Lenindzher Основы биохимии т.1 (1128695), страница 68
Текст из файла (страница 68)
Гл. а ФеРменты Дополнение 9-3. Кинетические тесты, позволяющие огличать конку- рентное ингибированне от неконкурегпного Использование графиков, построенных в двойных обратных координатах для анализа данных, полученных при исследовании ингибирования ферментативных реакций. позволяет лел ко отличать конкурентные ингибиторы от неконкурентных. Проводятся лве серии опытов по определению скорости реакции при одной и той же концентрации фермента. В одной серии концентрация субстрата тоже остается постоянной и соответствующими экспериментальными методами определяется влияние повышения концентрации ннгнбитора на начштьную скорость реакции сги В другой серии, наоборот, концентрация иигибнтора поддерживается постоянной, но используются разные концентрации субстрата. На основе данных, полученных в опытах той и другой серии, строят графики в координатах 1!г Я; 1~ар). На рис.
1 представлены такие графики, полученные в отсутствие ингибитора и при лвух разных концентрациях конкурентного ингибягора. В случае конкурентных ингибнторов получается семейство прямых с разными углами наклона пересекающихся в одной точке на оси 1/сб. Поскольку отрезок, отсекаемый на осп Ц,,„численно равен величине 1л1и,иии, Ясно, что 1'„„не изменветса в пРисУтствии конкУРентных ингибиторов. Это означает. что независимо от концентрации конкурентного ннгибитора всегда можно подобрать лостаточно высокую концентрацию субстрата, при которой субстрат выгеснит конкурентный ингибнтор из активного центра.
р!ллиинлр или ллбллри тири ! и л~ 1 йй Рлк. Х При неконкурентном ингнбированин аналогичные графики представляют собой семейство прямых !рис. 2), пересекающихся с осью 1,~~э"! в одной точке и отсекающих на ней отрезок, численно равный .- 1 Км. Это свидетельствует о том, что величина Км не изменяется при изменении концентрации неконкурентного ир-ибитора, тогда как величина р'лини при этом уменьшается.
ЧАСТЬ !. БИОМОЛЕКУЛЫ Неконкурентное ингибирование фермента можно отличить от конкурентного цугем анализа кинетических данных, выраженных графически в двойных обратных координатах, как показано в дополнении 9-3. Наиболее важные неконкурентные ингибиторы представляют собой образующиеся в живых организмах цромежуточные продукты метаболизма, способные обратима связываться со специфическими участками на поверхности некоторых регуляторных ферментов и изменять при этом активность их каталитических центров.
Примером может служить ингибирование 1.-треаниндегидратазы 1 -изолейцином, обсуждаемое в разд. 9.18. Тйблица 9-7. Факторы, влияющие на катали- тическую эффективность ферментов !. Сблюкеляе и оряентацвя субстрата ло огяошецию к катллцтической группе 2. Напряжение и деформация чувствительной к действию фермента связи, возникающие вследствие индуцированного соответствия между молекулами субстрата к фермента 3. Общий кислотво-основный катализ 4.
Ковалеятвый катализ том связь оказывается не только расположенной в непосредственной близости от каталитнческой грунцы, но и цравильно ориентированной цо отношению к ней. В результате вероятность того, что комплекс ЕЯ достигнет переходного состояния, сильно увеличивается (рис. 9-13]. Напряжение и дебуормацияг индуцированное соатаеяктвие. Присоединение субстрата может вызывать конформационные изменения в молекуле фермента, которые приводят к напряжению структуры активного центра, а также несколько деформируют связанный субстрат, облегчая тем самым достижение комплексом ЕЗ переходного состояния. 9.15. Факторы, определяющие лятеаиит ическую зффектииность ферментов Ферменты повышают скорости катализируемых ими реакций в 1О' — 1О'ц раз.
Нвлример„уреаза ускоряет гидрализ мочевиныв 1О'4 раз при рН 8 и 20'С. Как же удается ферментам проявлять такую необычайно высокую казалитическую активность в столь мягких условиях? Существуют четыре основных фактора (табл. 9-7), определяющих способность ферментов ускорять химические реакции. Сближение и ориентация. Фермент способен связывать молекулу субстрата таким образом, что атакуемая фермен- Рис йаз. Сзематцчкзолвзобрзжзцле процессов сближения ц црилцгзцлл цря вззцмллейстлял мцлзку!!ы субстрата 3 с загллягичзской группой з активном центре фзрмецга Е. Правильнее сближение, неправильная оряеята— цяя Пецравильцай ориентация, неправильное сближение Правильное сблнжецие, цравильцал цркенгцццл Гл.
9. ФеРмннты Неютарью протеи.лопараью грушм — СООН вЂ” с=сн / нн нн ! Н Н р р ЦЯИ)ОРИЬЮ ГР)ЛПИ1 — СОΠ— нн, | Конформационнае изменение — С=СН Нн Н С ! Н Каташзируемвя рвшщид 4ИВ Релаксировпнипл молекула субстрата + Рнс. 9-14. Инлуцнроевнное соответствие между активным центрам ферМекге н юстрюкеннаа формОЙ молекулы субстрата При этом возникает так называемое иидуи аравии пав соответствие фермента субстрату (рис.
9-14). Таким образом„небольшие изменения третичной или четвертичной структуры относительно крупной молекулы фермента могут играть роль механического рычага для молекулы субстрата. Возможно, что именно по этой причине ферменты представляют собой белки и, следовательно, по своим размерам значительно превосходят молекулы большинства субстратов. Оби)ий кислотночзсновный катализ. В активном центре фермента могут находиться группы специфических аминокислотных остатков, которые япляются хорошими донорами или акцепторвми протонов (рис.
9-15). Такие кислотные или оснбвные группы общего типа представляот собой мошные катализаторы многих органических реакций, протекаюших в водных системах. Рис. 9-1и Многие оргелнчюкне реекцни ускоряются донорами или екцепторвмн протонов, т.е. абобшышыми кнслотвмп или асновепнями. Актявные центры рада ферментов содержат фуюшпонакьиые группы еминокислатных остатков, прииимвююне участие в квтвлитических Процессах в кечесгве доноров или акцепторав протонов.
Здесь покезены некаторью из этих групп. — БН-группе прнввллежят пиатеину. нмилвзальивя грпгпв-гштгшнну. Некатахнзируемвя рввкцпв ЙХ+Н,О КОН+ НХ КХ + Š— ОН вЂ” ч КОН + ЕХ ЕХ -Н,О Е ОН -НХ Сумма)швя КХ е Н,Π— КОН + НХ рввкцив Ряс. 9-1б Одне из моделей ковалентисго катализа. В некоторых ферментвтивныХ ревкциах фермент звмжцяст функциональную группу К в субстрете КХ, в рюультвте чего образуется ковелентныа комплека ЕХ. Он нестебилен и гнлрализустся знечитальна быстрее, чем КХ. К ферментам, осуюеетвлюошим ковакснтный печенка отиаснтся химотрнпсии (дополнение 9-4, Б). члсть ь. ьиомолькулы Дополнение 9-4. Структура некоторых ферментов, определенная с по- мощью дифракции реп.пеновских лучей.
Методом рен ггеноструктурн ого анализа было исследовано большое число кристаллических ферментов. Результаты таких исследований часто сопоставляются с данными, полученными химическими методами при 1) опрелелении аминокнслотной последовательности ферментов, 2) изучении их субсгратной специфичности, 3) исследовании действия специфических ингибиторов и 4) идеьггификации специфических функциональных групп в активном центре. С целью выявления возможной связи между каталитическнм действием ферментов и их третичной структурой были изучены представители большинства основных классов ферментов (см, табл. 9-3).
Здесь показаны иэображения (в масштабе) молекул трех ферментов, иллюстрирующие некоторые их структурные и функциональные особенности, выявленные при рентгеносгрукгурном анализе кристаллов этих ферментов. А. Комплекс люовим — субстрат Хоья фермень-субсграпьые комплексы обычно неустойчивы и бысьро распадаются, иногда удается синтезировать аналог субстрата (нли получить химически модифицированный субстрат), который присоединяется к активному центру фермента и остается связанным с ним, но не подвергается еьо действию. Такой субстрат бьп найден для лизоцима, гидролизующего определенные связи в цепях бактериальных полисахаридов.
На рис. ! ьюкаэана !в масшьабе) предполагаемая структура нормального фермент-субстратного комплекса лля лизоцима. Это изображение было получено на основе данных реять.еноструктурьюго анализа кристаллического комплекса лизоцпма и «ложного», т.е. негидролизуемого. субстрата, представляющего собой аналог обычного субстрата лизоцима. Эти исследования были провелены Дэвидом К. Филлиььсом н его сотрулника- Ко««леняпьыд кааш:шэ. Некоьорые ферменты реаь ируют со своими субстратами, образуя очень нестабильные, коваленгно связанные фермент-субстратные комплексы, из которых в ходе последующей реакции образуются продукты реакции, причем значительно быстрее, чем в случае некатвлизируемых реакций (рис. 9-16).
Перечисленные выше четыре фактора, по-вилимому, вносят различный вклад в ускорение химических реакций ферментами разных типов, однако ни лля одно!о фермента пока це известно точного механизма, обеспечивающего ускорение той или иной специфической для него реакции.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
