Lenindzher Основы биохимии т.1 (1128695), страница 69
Текст из файла (страница 69)
9. ьб. Реитгеиоструктуриый анализ выявил важные структуриые особенности ферментов Метод рентгеноструктурноьо анализа позволил получить много важных сведений о структуре и каталитических механизмах ферментов (равд. 8-2 — 8-4). Он был использован для изучения целого ряда кристаллических ферментов. Результаты этих исследований дополнили информацию, полученную при химическом изучении ферментов. О некоторых наиболее важных успехах в этой области, достигнутых благодаря ренэтенострукгурному анализу, речь пойдет в дополнении 9-4, в котором представлена целая «галерея» структур ферментов. э51 (л.
а ьк минт.ы 4, 'Фч -:., ф Рве ми в Оксфордском университете. 17олипептилная цепь, включая Ви руины н атомы Н, показана красным цвегом. Участок молекулы субстрата, обозначенный черными линиями„лежит в канале (или щечи) молекулы лизоцима и удерживается в этом положении специфическими водородными связями (изображены ярко-красными линиями) между ферментом и субстратом. Молекула субстрата представляет собой полимер с чередующимися звеньями (М-ацетилглюкозамипа и Х-ацетилмурамовой кислоты, имеющих циклическую форму и связанных дру~ с другом гликозндными связями, обозначенными А Г (гл. ! 1).
Место, в котором молекула субстрата разрывается, показано пунктирной ливией. 6 1мчпкяиа ягкжв .«: гнкчв!и:;. вьп Химотрипсин это протеолитический фермент, секрегнруемый из поджелудочной железы в тонкий кишечник в ниде неактивна) о предшественника, илн зимогена, называемого хнмотрипсипогеном. Химотрипсиноген, представляющий собой полипептидную цепь из 245 амннокислогных остатков и содержащий пять дисульфидных связей, образованных пятью остатками цистииа, активируется в тонком кишечнике под действием другого протеолитического фермента- трипсина. Трипсин гцпролизует четыре пептидные связи и удаляет из молекулы химотрнпсиногена два дипеитюга в положениях 14 15 и 147 148.
В результате образуется активный химотрнцсип, состоящий из трех полипептидных цепей, ковалептно связанных двумя дисульфидными мостиками, один из которых соединяет А- н В-цепи, а второй. В- и С-цепи, как показано на рис. 2. Для проявления ак~ явности химотрипсина необходимы остаток гистиднна 57 и остаток аспа- 253 ГЛ 9. ФЕРМЕНТЫ рагиновой кислоты 102 в В-цепи, а также остаток серина 195 в С-цепи. Хотя по положению а аминокислотной последовательности эти остатки находятся далеко один от другого (и даже не и олной цепи), в третичной структуре молекулы фермента они оказываются очень близко друг к другу.
Это показано на масштабном изображении остова молехулы химотрипсина (рис. 3), полученном по данным рентгеноструктурното анализа кристаллического кимотрипсииа Дэвилом М. Блоу и его сотрудниками в Кембриджском университете, На этом рисунке изображены )(-группы только трех специфических аминокислатных остатков, входящих в состав активного центра. В Возмоисный механизм гидрояиза снеиифииеских пептидов зз моойхлпгино.л Исходя из того, что по данным рентгенострутстурного анализа, аминокислотные остатки Нтй-57, Айр-102 и бег-195 расположены в молекуле химотрипснна близко друг к другу, был предложен возможный механизм участия этих остатков в каталитическом цикле химотрипсина Было высказано предположение о том, что молекула связывается с ак.
тинным центром так, что ее гилрофобная ориентирующая группа плотно прилегает к внутренней поверхности гилрафобного икарманюз активного центра (рис. 4; разд. 9.11). При этом расщепляемая пептцлная связь оказывается рядом с гилроксильной группой Бег-195 (рис. 5). Рзы. 7. Первый продуктуходитиз активного Рис. б. Одна из связей в субстрате разрывается. пентрв. Рис. 1О. Апивьиаа связь между субстратом и ферментом разрывается. Рис. 11. Второй продукт уходит из активного пентра.
часть ь виомолвкулы Кислород этой гндроксильной з руины соединяется коввлентной сложно-эфирной связью с углеродом ацильной группы субстрата, что приводит к образованию промежуточного фермент-субстратного комплекса (рис. б; разд. 9.15). Гидрокснльная группа серина легко теряет свой атом вспорола. так как он сильно притягивается водородной связью к электроотрицательному атому азота в имидазольной К-груззпе Н(з-57. Одновремеюзо происходит разрыв пептидной связи, в результате чего образуется первый продукт реакции. После его выхода из активного центра ацильная группа субстрата остается ковалентно связанной состатком серина 195 в молекуле фермента; это производное называется аци.з4ерлзентом (рис.
7]. Его сложно-эфирная связь очень неустойчива по сравнению с пептндной связью субстрата и гидролизуется с образованием второго продукта, представляющего собой карбоксильную часть субстрата.! 1ри этом протон вновь присоединяется к серзииу (рис. 8 н 9) и образуется комплекс фермент — продукт (рнс. 1О).
Второй продукт уходит затем из активного центра, и каталитический цикл завершается (рис. ! 1). Ацилфермент представляет собой ключевой промежуточный комплекс в этом варианте ковалентного катализа. Имндазольная гругша гистиднна 57 участвует в перемещении протона по механизму общего кислотно-основного катализа. Было высказано предположение, что роль остатка аспарагиновой кислоты !02, несущего большой отрицательный заряд, заключается в том. что он усиливает подвижность имидазольной группы гнстидина 57, в результате чего последний становится способным притягивазь атом водорода серина 195. Однако возникают сомнения относительно гого, существует лн на самом деле такая «эстафета» электрических зарядов, поскольку аспарагиновая кислота 102 и гистиднн 57 находятся слишком далеко друг от друга.
Но какова бы ни была функция остатка аспарагиновой кислоты 102, ясно, что он необходим для каталитического действии фермента. Г. ИндузЗированное сотвветствие мезндэ молекулой гексокнназы и одним из ее субстратав- й-глюкозой Гексокиназа, катализирующая фосфорилирование Р-глюкозы н других гексоз в реакции с АТР АТР + Р-глюкоза — АОР + О-глюкоза-б-фосфат, состоит из двух полнпептидных субьеднниц, как показано на масзптабном изображении просзранственной модели ее молекулы (рис. 12).
Рядом с «пустой» молекулой гексокиназы изображена также свободная молекула О-злюкозы (темпо-красный цвет). Когда молекула О-глюкозы связывается с активным центром фермента в отсутствие второго субстрата. т.е. АТР. обе субъединицы гексокнназы сближаются, так что молекула глюкозы оказывается в «кармане» активного центра (рнс. 13). При этом в четвертичной структуре фермента пронсхолят ловольно сушесзвенные изменения, так как при образовании комплекса гексокнназа--глюкоза в отсутствие АТР гексокиназа подвергается «вынужденной подгонке» к молекуле субстрата. Эзот комплекс достаточно стабилен, и его удалось получить в кристаллическом анде. Ренззеноструктурный анализ этого комплекса был проведен Томасом А.
Стейцем из Йельского университета. Если олновремешю присутствуюз и АТР н глюкоза, они связываются со гл я Фьпменты и-г Лоикагко г гк оогакааа — глюка 1а Гаксокиаопа Рис !3. Рис. Гз своими специфическими центрами, после чего происходит каталитическая реакция с образованием и последующим освобожлением АОР н глюкозо-6-фосфата. Фермент при этом вновь принимает первоначальную конформацию, чтобы начать новый каталитический цикл.
Прежде всего рентгенострукт урн ый анализ позволяет определить вторичную, третичную и четвертичную структуры молекул различных ферментов, что дает возможность сравнивать их с соответствующими струкаурами некаталитических слобулярных белков. Такие сравнения не выявили никаких специфических особенностей в трехмерной структуре ферментов, по которым они отличались бы от некаталитическнх белков.
Однако ферменты, приналлежащне к олпому классу йзапример, ферменты, катализирующие перенос фосфатных групп от АТР на молекулы, играющие роль акцепторов фосфата) могут облапать какимиго общими лля всех них структурными особенностями. Кроме то~ о, благодаря рент1 еноструктурному аначизу были идентифицированы активные центры мно~ их ферментов. Активный пентр часто представляет собой щель Р1ли углубление) на поверхности молекулы фермеап а; по своей форме зта щель оказывается комплементарной входящей в нее молекуле субстрааа, У одних ферментов активные центры выстланы пщлямн полипептилпых цепей, находящихся в Р-конформации, а у других они имеют форму «кармапа», внутреннюю поверхность которо~о образуют аминокислотпые остатки с заряженными полярными группами.
В некоторых случаях рентгеносзруктурпгяй метод позволил определить структуру фермент-субстратного комплекса. Приме- чхсть ь ьиОмОлекулы ром может служить фермент л«зоеим (дополнение 9-4, А), разрывающий определенные связи в остове бактериальных полисахарндов. Благодаря сочетанию рентгеноструктурных и химических исследований была выяснена детальная топография активного центра химотрипсина, состоящего нз трех полипептидпых цепей, соединенных друг с другом дисульфидными связями остатков аистина (дополнение 9-4, Б). Химические исследования показали, что при инактивации химотрипсина диизопропнлфторфосфатом образуется ковалентное производное остатка серина в положении 195 полипептидной цепи; отсюда следует, что этот остаток входит в состав активного центра. По данным других химических исследований, остаток гистидина в положении 57 и остаток аспарагиновой кислоты в положении 1Ы также участвуют в каталитическом процессе.
Хотя эти остатки занимают в полнпептилном остове положения, находящиеся лалеко друг от друга, и даже в разных полипегггндных цепях, данные рент~ еноструктурного анализа свидетельствуют о том, что в трехмерной структуре свернутой нативной молекулы химотрипсина (дополнение 9-4, Б) они расположены в пространстве очень близко друг к другу Этн точные данные о структуре химозрипсина в сочетании с результатами химических исследований фермента позволили предложить ряд механизмов каталнтнческ<зго действия химотрипсина (дополнение 9-4, В). а также исключить некоторые другие механизмы, не соответствующие данным о структуре активного центра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
