Lenindzher Основы биохимии т.1 (1128695), страница 40
Текст из файла (страница 40)
Укороченный пептид снова подвергается той ЧАСТЬ Ь БИОМОЛЕКУгЛЫ гшгцлтиогидццтоииопов произлодиое !Ч-кон- цовой аминокислоты а 1 йчяшзнзо- ~) ! Фелилгиокврбамоилышя группа Н -С вЂ” ХН К, ио Феииятиокарбамоил- тптрацептид тетрацвлтид же серии реакций, что позволяет идентифицировать новый 1Ч-концевой остаток. Повторяя таким образом отщеплеиие одного за другим Х-концевьгх остатков, можно легко определить амииокнслотную последовательность пептидов, состоящих из 10-20 остатков. Определение амииокислотной последовательности проводится для всех пептидов, образовавшихся под действием трипсииа.
После этого сразу же возникает новая проблема-определить, в каком порядке трипсииовые фрагменты располагались в первоначальной полипептцдиой цепи. Рис. б-э. Схемвопредедеция вмииокислотцой последовв ггдьиости в ел типе лугем его рвицеп- леи и я по Здмвиу. Исходный тетрппептид всгу- ппст в ревкцию с фепилизотиоцививтом„в ре- зультвте чего сбрвзустся феиилтиокврбвмоиль- иое произ всдиое ямпиокоилевог о остатка.
Этот оствток отшепляют от пелтидв без рвзрмвв лру- гих лептидиых сашей и получают в виде февил- тиогядввтоииового произволиого, которое мелло идеитифипировять хромвтогрвфическим способом. Остввшийс» трипептид вновь прово- дят через тот не цикл репкций, что позволяет илеитифицировкть второй остяток.
Зти олерв- ции повторяил ло зех пор, покв ие будут илеити- фицироввиы все остятки. вую порцию препарата исходного полипептида и расщепляют его на более мелкие фрагменты каким-либо иным способом. при помощи ко~срого расгцепляются пептидиые связи, устойчивые к действию трипсина. В этом случае более предпочтигельиыьг часто оказывается не фермеитативный, а химический метод. Особенно хорошие результаты дает реагент бромйнан, расщепляюгций толь- д. Стадия 5: раеиуепление исходной полипептидной цепи еггуе одним способом Чтобы установить порядок расположения пептидных фрагментов, образовавшихся под действием трипсина, берут но- тиоциаинг !! С Я + НН, ! к,— сн ! С=О ! НН К,— СН ! С=О ! Н1ч К,— СН ! С=О НХ к,— сн ! СООН К,— СН ! С=О ! НН К„-СН С=О НХ Кз — СН ! С=.-О ! НН к,--сн СООН Нн,, Кг -СН С=О Нн К.,— СН С=О НХ ! К,— СН СООН Иохолцый пецтид минус !з1-колцевой остаток 15! ГЛ.
6. БЕЛКИ'. КОВАЛЕНТНАЯ СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ Рис. 6.1Ю Расположение пептилньа фрагментов в правильном порялке иа основе данных по перекрывающимся участкам. В приведенном злесь примере полипептид, состоящий из 16 выииохисиотных остатков, пссхе илентнфикапии 1Ч- и С-коипевых остатков был полвертнут фратмеи пшии лвумя споообамн Веерку хюказаны почученныефрапчепты. а енизу- воссоздание поххннт последовательности полипсптнда по яерекрываюшимся участкам. С-концевой остаток фра менты первого расщепления Фрагменты второго расщепдьщия Определение последовательности по перекрывающимся участкам Концевые остатки жр-Ф-йй) илн а-Ф-Ф м-в: в-и:-а иви-а и-и-е и-и Перекрывающиеся участки Второй набор ие(й ич1птб чх)б ишм:(тм повем.,у ~ вима у ~ ~.:, ~~~ н Перекрывающиеся участки полУченнаа Я ф Щ иы1иф У,хеи Яма(; х(чи( иянв У (вяв раб .~ поцледова- гслыюст1 ко те пептидные связи, в которых карбоннльная группа принадлежит остатку метионина (табл.
6-6). Следовательно, если полипептнд содержит восемь остатков метионина, то при обработке бромцианом обычно образуются девять пептидных фрагментов. Полученные таким способом фрагменты можно разделить методом злектрофореэа или хроматографии. Каждый из этих коротких пептидов подвергают расщеплению по Эдману, как было описано для стадии 4, и таким путем устанавливают их аминокислотную последовательность. Итак, мы получили два набора пептидных фрагментов -одгпу после обра/(апные эксперимента )т)- концовой остаток йх' ботки исходного полипептнпа трнпснном и другой после химического расщегсчения того же полипептида бромцианом.
Мы знаем также аминокислотную последовательность каждого пептидгч входящего в состав этих двух наборов. 152 ЧАСТЬ 1. БИОМОЛЕКУЛЪ| И-конЦы С|т йв Ча| ! С!ц ! С!и б 4 ,. Ча1 ! Явг !пц Ту ы С|п |.вц ! С!ц ! Азп ! Туг го Суа Азп Т Ча! ! Суа г! и — э — ' го С!у С!ц Агк С1у РЬв ! зо РЬв Ту ! ТЬг ! Рго ! Еуз зо А)а С-концы В-цець А-цеш Риа. 8-11. Первичная структура бычьаго инсу- лина.
Показаны аминокислотиыа ласладова- тольности кавШоя из двуз попса и поларачныс связи. А-асана молокулаз инаулнна человеке, свиньи. аобыги, кролика и кашалота идентичны. Идентичны также В-цони инсулинов коровы, свиньи, собаки, казы и лошади. Амвиокис- лотиыо замены в А-цопи обычно наблюдаются в лоложси ион 8. 9 и 10 !выдалоны красным цветом). е. Стадия б: установление порядка расположения лептидных 4рагментов ло перекрывающимся участкам Теперь сравнивают амннокислотные последовательности в пептидных фрагментах, полученных двумя способами из исходного полипептида, чтобы во втором наборе найти пептиды, в которых бы последовательноати отдельных участков перекрывались !т.е.
совпадали) с последовательностями тех или иных участков в пептидах первого набора. Принцип расположения пептидов показан на рис. 6-!б. Пелтиды из второго набора с перекрывающимися последовательностями позволяют соединить в правильном порядке пептидные фрагменты, полученные в результате первого расщепления исходной полипептидной цепи. Более того, эти два набора фрагментов позволяют выявить возможные ошибки в определении амннокнслотной последовательности каждого фрагмента. Иногда второго расщепления полипептида на фрагменты оказывается недостаточно, чтобы найти перекрывающиеся участки для двух или более пептидов, полученных после первого расщепления. В этом случае применяется третий, а то и четвертый способ расщепления, что позволяет в конце концов получить набор пептидов, обеспечивающих перавгрывание всех участков, необходимых для установления полной последовательности исходной цепи.
При этом для расп|епления полипептнца можно использовать другие протеолнтические ферменты, например химошрцпгин или пенсии; правда, зги ферменты расщепляют пептидные связи гораздо менее избирательно, чем трипсин !табл. 6-6). бЗ.
Инсулин-это первый белок, дли которого была установлена аминпкнслотнаи последовательность Мы теперь знаем принципиальную схему опрелеления аминокислотной последовательности полипептицных цепей. Рассмотрим результаты, полученные РЬв ! Ча| ! Аап ! С1п ! з Н!в ! Ьвц б Суз С!у ! Явг го Н!в ! !иц чы ! С!ц А!а ! гь Ьнц ГЛ. 6. БЕЛКИ: КОВАЛЕНТНАЯ СТРУКТУРА И ФУНКЦИ1! 153 н о Цепь 1 -"!Ч вЂ” С вЂ” С ! Н СН, ФисульФилная поперечная ! связь и ! СН, Ц и --1Ч вЂ” С вЂ” с-- Н О Н О ! ""Ы С С-- Цепь 1 ! ! н сн Поперечная связь ра- БО,Н зор, , ! Н СН, ! С вЂ” С-- Цепь И Н О два остатка писзеи- ноной кислоты о ! и- я — о-он Налмуравьиная кислота Остаток аистина Сэнгером при установлении аминокислотной последовательности бычьего инсулина; эта последовательность приведена на рис.
6-1!. Бычий инсулин имеет молекулярную массу около 5700. Его молекула состоит из двух полипептидных цепей: А-цепи, содержащей 21 аминокнслотный остаток, и В-цепи, содержащей 30 амннокислотных остатков. Эти две цепи соединены двумя дисульфидными ( — Б- — Б — ) поперечными связями, причем в одной из цепей имеется еще одна внутренняя дисульфндная связь. При определении последовательности вначале были разорваны поперечные дисульфндные связи, что позволило разделить пепи.
Для этой пели Сэнгер использовал в хачестве окислителя надлзураньпнузо кислоизу, которая расщепляет каждый остаток цистина на два остатка цистеиновой кислоты (рнс. 6-12), по одному в каждой цепи. После разделения цепей в них были определены аминокнслотные последовательности. При этом не удалось обнаружить никаких закономерностей в расположении какой-либо аминокислоты, никаких периодических повторений того или нного аминокислотного остатка. Более того, последовательности двух цепей оказались совершенно разнымхь Успешное определение аминокислотной последовательности в цепях инсулина способствовало интенсивному изучению взаимосвязи между структурой инсулинов, выделенных из различных видов, и их биологической активностью, связанной с регулацией обмена глюкозы. Для биологической активности инсулина Рис.
6-!Х Рлсшенленинписульфилных попе- речных связей налмуральиной кислотой. необходимы обе цепи- А и В. Более того, необходимо, чтобы обе поперечные днсульфндные связи оставались нерасщепленными. Удаление части остатков из той нлн лругой цепи путем их избирательного отщепления приводит к частичной нлн полной потере активности. Хотя ннсулины, выделенные из поджелудочной железы нескольких видов животных-коровы„свиньи, овцы и кашалота, сохранюот гормональную активность в организме человека и могут быть использованы для лечения больных диабетом, они все же не идентичны инсулину человека. Тем не менее весьма существенно то, ч.го в каждой цепи инсулина в определенных положениях всегда присутствуют олни и те же аминокислоты независимо от вида, из которого был выделен данный инсулин. Однако в других положениях аминокислоты могут различаться у разных видов.
Этн наблюдения убедительно свидетельствуют о том, что биологическая активность инсулина зависит от амннокнслотной последовательности его цепей, а также от наличия в определенных положениях поперечных связей макду цепями. 6.9. В настоящее время известны последовательности многих других белков Успех Сэнгера сразу же побудил рял других исследователей заняться определением аминокислотных последователь- ЧАСТЬ 1. БИОМОЛЕКУЛЫ ностей еще более длинных полипептидных цепей.
Очень скоро была установлена аминокислотная последовательность адренокортикагпропного гормона (кортикотропина. АКТТ) — гормона передней доли гипофиза. стимулирующего рост и активность коры надпочечников. Этот гормон состоит из одной полипептидной цепи. содержащей 39 аминокислотных остатков, с молекулярной массой около 4600. К концу 1950-х гг. была установлена последовательность перво).о фермента — рибонуклепзы; зту работу выполнили Стэнфорл Мур и Уильям Стейн из Рокфеллеровского института, а также Кристиан Анфинсен с группой сотрудников из Национюгьных институтов здравоохранения (США). Молекула бычьей рибонуклеазы содержит в своей единственной цепи 124 аминокислотных остатка и четыре внутрицепочечные —  —  — связи (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
