Lenindzher Основы биохимии т.1 (1128695), страница 39
Текст из файла (страница 39)
В этом году Джеймс Д. Уотсон и Фрэнсис Крик в Кембридже (Англия) создали модель структуры ДНК (лвойную спираль) и высказали предположение о структурной основе точной репликации ДНК. В этом предположении, по существу (хотя и не в явной форме), была выражена идея о том, что последовательность нуклеогидных звеньев ДНК содержит в себе закодированную генетическую информацию. В том же з-оду Фредерик Сэнгер, работавший в Кембридже в той же лаборатории, расшифровал последовательность аминокислот в полипептидных цепях ~армана инсулина. Это достижение само по себе имело большое значение, так как в течение лолгого времени считалось, что определение аминокислотной последовательности полипептида представляет собой совершенно безнадежную по трудности задачу.
Но, кроме того. результаты, полученные Сантером, практически одновременно с появлением гипотезы Уотсона — Крика, тоже наводили на мысль о существовании какой-то связи между нуклеотидной последовательностью ДНК и аминокислотной последовательностью белков. В следующее десятилетие эта идея принела к расшифровке всех содержащихся в ДНК и РНК нуклеотидных каповых слов, которые однозначно определяют аминокислотную последовательность белковых молекул. До работы Сзнгера.
на выполнение которой ушло несколько лег, не было уверенности в том, что все молекулы данного белка являются строго идентичными по молекулярной массе и аминокислот- ному составу. В настоящее время известна аминокислотнан последовательность многих сотен белков, выделенных из различных источников. Определение аминокислотной последовательности полипептидной цени основано на принципах, которые впервые были развиты Сэнгером. Они используются еше и сегодня, 147 гл.
6. бплки: ковдлвнтндя структура и 4 ункции правда со всевозможными вариациями и усовершенствованиями. Чтобы расшифровать аминокислотную последовательность любого полипептида, необходимо осуществить шесть основных стадий. а. Стадия 1г гзлределение аминокислотггого состава Первым шагом на пути к расшифровке . амннокислотной последовательности служит гидролиз всех пептилных связей чистого полипептцда. Образующаяся смесь аминокислот анализируется затем при помощи ионообменной хроматографии (разд.
5,18), что позволяет определить, какие аминокислоты и в каком соотношении присутствуют в гидролизате. б. Стадии 2: идентификация амина- и карбоксикоицевых осзнагл ков Следующий шаг состоит в идентификации аминокислотного остатка„находящегося на конце полипептндной цепи, не1ЧОк МН, 1 й; — СН СООН Хнт 1 й,— СН 1 СООН Хн 1 К, — СН 1 СООН 2,4-днннтрофени те минскислота, ооответотвуюыня й-лоицевокгу остатку Низ К4 — СН 1 СООН СВОбОдные ньяпгоюгслоты 2,4-диннтрофвние- тнгряпептид ин, Р., — СН 1 С=О Нн нр К, СН вЂ” 2— С= — О НХ 1 Рз —.СН С=О НН 1 К4 — СН СООН Тнгрлпептид ин й, -СН 1 С=-О 1 Нтч 1 й,— СН С=О 1 НХ 1 й,— СН С= — О 1 НИ й„— СН 1 СООН сущего своболную а-аминогруппу, т.е.
на аминоконце (ХНз-конце, или )ч)-конце). Для этой цели Сзнгер предложил использовать реагент, 1-фтор-2,4-динитробензол (равд. 5.22), который можно присоединить в качестве метки к аминоконцевому (Х-концевому) остатку цепи, в результате чего образуется окрашенное в желтый цвет 2,4-диннтрофенильное (ДНФ)-производное полипептнда.
При кислотном гидролизе все пептидные связи в ~аком ДНФ-производном полипептнпа расщепляются, однако ковалентная связь между 2,4-дннитрофеннльной группой и а-аминогруппой Х-концевого остатка остается пезатронутой. Следовательно, )ч)-концевой остаток будет представлен в гндролизате в виде 2,4-динитрофенильного производного (рис. б-б). Это производное легко отделить от незамещенных свободных аминокислот Рис. 6-6.
Идентификяпия вминоконпевого остатка тстрвпептиде путем получения 2,4-дини- трофснильногс проюводного. Тетрепептил вступает в реекпию с! -фтор-2,4-линитробензо- лом 1ФДНБ) с обрезоввиием Д4-динитрофс- нильного производного. Последнее полвергяют затем кипячению в присутствии 6 н. НО с тем, побы ряюпогить мс псптидные связи. При этом еминоконневвя еминокислотя согнется в виде 2,4-лннитрофенильного производного. 148 ЧАСТЬ Ь БИОМОЛЕКУЛЫ 'С~ г Х О ! МН ! Дг — СН ! С=О НХ ! Н,— СН ! С=О ! НХ ! Б,— СН СООН Трипептид, меченный дансилхлоридом Н,С СН, О Б О г(щчсиххлорид Рнс.
б-Х Введение метки в аминокои невой оста- ток трипепгида с помощью дансилхлорида. По- сле гидролитического расщепления всех пеп- гидных связей дщюильное производное амино- конпевой аминокислогм можно выделить и иденгнфинировагь. Благодаря интенсивной фпуореспенщщ дансильных групп они вы- являются в значительно меньших количествах, чем двннгрофенильные группы.
Поэтому дан- с и тьный метод по чувствительности намного превосходит метод с использованием Фгопдини- гробензола. и идентифицировать хроматографическим способом путем сравнения его с аутентичньььги динитрофеннльными производными различных аминокислот. Другим реагентом, используемым в качестве метки, позволяющей эщентифицировать )Ч-концевой остаток, служит дансилхлорид (рис. 6-7), который реагирует со свободной з-амнногруппой и лает лансильное производное. Последнее интенсивно флуоресцирует, вследствие чего его можно обнаружить и измерить при значительно более низких концентрациях, чем динитрофеннльные производные.
Карбоксиконцевой (С-концевой) аминокислотный остаток полипептидной цепи тоже можно идентифицировать, используя тот или иной метод. Один из таких методов состоит в ннкубировании полипептида с ферментом карбоисипептидазод, которая гидролизует только пептидную связь, находящуюся на карбоксильном конце (СООН-конпе„ или С- конце! цепи. Определив, какая из аминокислот первой отщепилась от полипептида при действии на него карбоксипептидазы, можно идентифицировать С-концевой остаток. В результате цдентификвции )Ч- и С- концевых остатков полипептида мы получаем две важные реперные точки для определения аминокислотной последовательности. в.
Сннгдггл 3: расщепление нолинепгпидной цени на фрагл|енты Теперь мы берем еще одну порцию анализируемого препарата, содержащего неповрежденные полипептидные цепи, и расщепляем их на более мелкие куски— короткие пептиды, состоящие в среднем нз 1О-1 5 аминокислотных остатков. Цель этой операции заключается в том, чтобы разделить полученные фрагменты и определить в каждом нз них амннокислотную последовательность. Для расщепления полипептидной цепи на отдельные фрагменты можно использовать несколько методов.
Один из широко распространенных методов-это частичный ферментативный гидролиз полипептида под воздействием пищеварительного фермента тринсина. Каталитическое действие этого фермента отличается высокой специфичностью: гидро- лизу подвергаются только те пептидные связи, в образовании которых участвовала карбоксильная группа остатка лизина или аргинина независимо от длины и аминокислотной последовательности полнпептцдной цепи (табл. 6-6). Число более мелких пептидов, образующихся под действием трипсина, можно, следовательно, предсказать, исходя из общего числа остатков лизина и аргинина в исходном полипептцде. Полипептид, в котором содержатся пять остатков лизина и (или) аргинина, при расщеплении трипсином обычно дает шесть более мелких гЛ.
а. БеЛки: кОВАленТНАЯ СтРуктуРА и Функции Обрябшкя Тачка ркашсннання 1асгкгкн, катарыы арннкдяажнх ккрбаннаьняя грудах ркащсадяаыай ааахнднай сакэя) Трнаснн Хныотрнпснн Лизин Аргнннн Фанидаданнн Триптофан Тнрознн Фаннлаланнн Трнптофан Тнрозни Некоторые другая остат- ки Матноннн Н епкин Броыннан В эгаы ф накран- ~ ланях праведана хра- ыахагра- фяя паата нанесения В этом нядраняанкн смеси аадтндсж праведен эдекгвафюраэ Рнс. б-В.
Пснхнднкя кяртк, полученная после рксшсадяння нормального гаыагяабння челове- ка грннаннаы. Каждое пятно садаржнг один нз агдгндая. Чтобы получить такую двумерную «ярку, аыссь пептидов наносят ня лиаз. бумаги кяядвкгнай формы, проводят эяскграфараз я айном направлении, параллельном одной нз сторон кяядвягя, после чсга бумагу высуши- вают, к затем проводят храыкгагркфнчкскаа разделение ааагндая н другом няаряяданнн, аер- аанднкулярнам первому. Нн один нз этих двух арансссая я агдаяьнасгн не аазяадяст разделить асагнды полностью, однако ааададаякхаяьнаа нк асушаагяаснне акязыяяагся очень эффак- тняныы саасабаы разделения сложных аеа- хндных сыассй. Таблица б-б. Специфичность, свойственная четырем важныы мстолам фрагыентаннн но- лндептндных цепей пептидов, причем все эти пептиды, за исключением одного, имеют на карбоксильном конце остаток лизина или аргинина.
Фрагменты, полученные под действием трипсина, разделяют либо методом ионообменной хроматографии на колонке, либо при помощи электрофореза и хроматографии на бумаге; при этом часто проводят двумерное хроматографическое разделение пептидов на листе бумаги, в результате чего получают хроматограмму с распрсделияшимися на ней пептидами в виде нентиднай карты (рис. 6-3). г.
Стадия 41 определение последовательности пептидных фраглгентов На этой стадии устанавливается ами. нокислотная последовательность в каждом из цептидных фрагментов, полученных на стадии 3. Обычно для этой цели используют химический метод, разработанный Пером Эдманом. Расщепление па Эдману сводится к тому, что метится и отщепляется только Х-концевой остаток пептпда, а все остальные пептидные связи не затрагиваются 1рис. 6-9). После идентификации отшепленного Х- концевого остатка метка вводится в следующий, ставший теперь Х-концевым ос~атак, который точно так же отщепляется, проходя через ту же серию реакций.
Так, опцепляя этим способом остаток за остатком, можно определить всю аминокислотную последовательность цептида, используя для этой цели всего одну пробу. На рис. 6-9 показано, каким образом осуществляется раацепление по Эдману. Вначале пептид взаимодействует с фенилизаеиоиианатом, который присоединяется к свободной и-аминогруппе Х-коицевого остатка. Обработка пептида холодной разбавленной кислотой приводит к отшеплению Х-концевого остатка в аиде фенимтгогидантоило. ваго производного, которое можно идентифицировать хроматографическнми методами. Остальная часть пептидной цени после удаления Х-концтюго остатка оказывается неповрежденной.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
