Э. Дероум - Современные методы ЯМР для химических исследований (1125882), страница 73
Текст из файла (страница 73)
8.39 Схематический двумерный спектр ПЧАОЕ( Н11АТЕ для последовательности систем АХ. Те части спектра, которые расположены снаружи от заштрихованных лилий, не могут содержать сигналов. 02 Это основная двумерная последовааельность 1)ЧАПЕ(НАТЕ.
Как и в случае СОКУ, я сначала собираюсь обсудить получаемые при этом результаты и лишь затем сравнительно кратко обратиться к техни- ческим деталям проведения экспернмента. Двумерные спектры ГэчэАПЕ( Н)АТЕ. Частоты двухквантовых переходов, совершающие эволюцию в течение периода г, этоао эксперимента, являются просто суммой химических сдвигов (относительно частоты передатчика) для тех пар ядер, которые участвуют в формировании двухкваитовой когерентностн. Пики в двумерном спектре, соответствующие двум ядрам со сдвигамн тх и гю имеют координаты ((57 -~-аэа), Х), ГдЕ Х-ЧаетОта ОдИОКВантОВОй КОГЕРЕитиОСтн, В КОтОруЮ переводится намагниченность действием послсдисго импульса. Как мы вскоре увидим.
для сильных ядер, например 'Н, это может приводить к некоторому усложнению; данный экспернмент изобретен и продемонстрирован для ядер '5С ГЗ]. Преимущество рассеянных ядер, таких, как углерод, состоит в том, что в конечном спектре заметную интенсивность имеют только сигналы от двухспиновых систем АВ нлн АХ. Оии возиикааот благодаря тому, что 0,01% молекул вещества содержит доа атома 'ОС. Значительно более интенсивные сигналы от одиночных атомов 'ОС устраняются за счет двухкваитовой фильтрации, а сигналы от молекул с тремя атомами "С (трехспиаэовые системы) имеют пренебрежимо малую интенсивность.
Можно так подобрать значение т, Двумерная корреляционная спектроскопии ЯМР что будут наблюдаться только сигналы от атомов, связанных большимн по величине прямыми константами. Таким образом, для каждой частоты по ээ„по которой наблюдается сигнал, можно выделить прямую, параллельную нз, на которой будут находиться компоненты систем АВ или АХ для пары связанных атомов 'ОС, т.е.
в двумерном спектре возникнут дублеты прн Иээ -~- аэв), чх) н И574 ч- г„), 570). Центр между каждой парой снгналов попадает в точку Нчх + 579), 1574 Ч- чв)772), поэтому эти точки лежат иа линии, имеющей коэффициент наклона, равный 2 (рнс. 8.39). Этот факт можно использовать для того, чтобы отличить истинные сигналы от артефактов. Поясним это на примере соединения 7 (рнс. 8.40). Поскольку каждый 150 ИО 150 ОО ОО 100 90 ОО 7 бо 50 40 59 20 м,О Рис. 8.40.
Двумерный слектр 11ЧАЮЕО))АТЕ 'эС аимоаеаа 17). Время регистрации цо 2, составляло 30 мс 1256 иикрсмеатов ари слсктральаой полосе 9 кГц; 128 прохождений аа иикремеит). Остаточные однокваатовые сигналы видны на лилия ч, = О. Поскольку 2 было подобрано лля средней ло величине коастааты С С между Олифатическими углеродами, дв» корреляциоаных пика за счет взаимодействия через двойную связь имели низкую интеасивиость и ие проявились иа графике.
Глава 8 337 336 Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР неконцевой атом углерода связан с двумя нли более партнерами, в принципе может быть восстановлен весь скелет молекулы (если только нет разрывов в углеродной цепи, как во фрагментах С вЂ” Х вЂ” С). Начиная, как обычно, с наиболее легко относимого сигнала, мы проходим по линии, соответствующей его химическому сдвигу на оси уг н параллельной уг, до тех пор, пока не обнаружим сигнал. Двигаясь далее параллельно уг, мы определим одного из его партнеров по спин-спиновому взаимодействию.
Стартуя опять с этого сигнала и повторяя то же самое, мы, очевидно, определим очередного партнера по спин-спнновому взаимодействию. Этот метод открывает феноменальные возможности, но одновременно имеет исключительно низкую чувствительность. Его недостаток состоит в том, что мы пытаемся наблюдать сигналы, интен- 25 52 сивность которых равна интенсивности С-сателлнтов от сигналов С, т.е.
возникающих лишь от одной нз 10000 молекул. Это исключает возможность использования эксперимента для большинства реальных задач, однако он может найти применение в биохимических исследованиях с соединениями, меченными по С. 25 Если мы проделаем то же самое для такого сильного ядра, как Н, то 2 проблема чувствительности исчезает, но вместо нее возникают другие сложности [14]. Выбор задержки т в случае "С прост; для систем АХ ее оптимальное значение составляет 1/4У (для сильносвязанных систем нужны несколько различающиеся значения, см. книгу [53).
Диапазон значений 2 для прямых углерод-углеродных констант относительно невелик (примерно 35 — 55 Гц). Для протонов, напротив, зависимость т от У оказывается более сложной нз-за того, что часто приходится иметь дело со сложнымн спнновыми системамн, да н диапазон изменения констант спин-спинового взаимодействия оказывается шире (для сравнения, скажем, от 2 до 20 Гц). Другая проблема для систем, содержащих более двух спинов, состоит в том, что двухквантовая когерентность при действии последнего импульса может перераспределяться по всем переходам в спиновой системе; это усложняет интерпретацию каждой строки по уг, соответствующей сигналам от пары связанных ядер.
К счастью, этот недостаток может быть частично устранен в результате того, что последний импульс задается равным Зл/4, а не л!2, что по аналогии с СОВУ-45 ограничивает большую часть перераспределения теми переходами, в которых участвующие ядра непосредственно формируют двухквантовую когерентность [141 (здесь термин «непосредственно» используется в прямом смысле, безотносительно связи между переходами). На рнс. 8.41 представлен протонный двумерный спектр 111АГгЕ151)АТЕ 2,3-дибромпропноиовой кислоты с завершаюшнми импульсами л/2 и 3л/4.
Преимущество этого эксперимента по сравнению с СОВУ заключается в том, что в нем отсутствуют диагональные пики, Поэтому для очень сложных задач можно с помощью двумерного спектра 1ХАОЕО1)АТЕ определить те корреляции, которые трудно найти в спектре СОКУ, когда соответствующнй кросс-пик расположен близко а а а а а « г а а "т -ооа «ао ~оо Га г» 5аа а ааа -лю л» га а аао -гаа Га Рис. 8.41, Двумерные спектры 11ЧАЕ5Е12ПАТЕ 5Н 2,3-либромпропиоиовой кислоты с варьированием угла последнего (или «считывающего») импульса.
Пики, возникающие в результате нежелательного переноса намагниченности к «пассив- ным» сливам, помечены стрелками аа левом спектре. к диагонали. Неудобство заключается в меньшей общности. Для этого метода невозможно задать оптнмальное значение т, подходящее для всех возможных величин констант и типов расположения ядер. В настоящее время уже есть ряд примеров, демонстрирующих полезность этого метода для анализа спектров ЯМР белков [153, но пока еше рано делать вывод о том, что окажется важнее — преимущества или недостатки. Для спектроскопии ЯМР малых молекул этот эксперимент определенно не является экспериментом первой необходимости, однако его можно рассматривать как альтернативу в тех случаях, когда СОВУ или его модификации не дают ответа на поставленный вопрос.
Детали двумерной последовательности П»1АВЕЯТ)АТЕ. Прн задании параметров для этого эксперимента мы сталкиваемся с обычнымн проблемами двумерной спектроскопии: выбором ширины спектральной полосы, параметров оцифровки н фазового цикла. В литературе имеется целый ряд подходов к нх решению. Метод активно использовался в нескольких исследовательских группах, а детали его выполнения сильно меняются в зависимости от возможностей н конструкции спектрометра, которые существенно изменялись. Я собираюсь рассматривать его так же, как это было сделано для 015Р— СОВУ и СОВУ, но для полноты упомяну некоторые другие возможности, с которыми вы можете столкнуться. Создавая фазовый цикл, мы должны иметь в виду двухквантовую фильтрацию, подавление артефактов и квадратурное детектирование по 22-75 338 Глава 8 339 двумерная коррвпяционная спектроскопии яМ Р в,. Двухквантовая фильтрация может достигаться точно так же, как и для ПОР -СОВУ. Мы используем тот факт, что сдвиг на 90* фазы возбуждающей части последовательности (первые три импульса) ннвертирует сигналы, возникающие за счет двухквантовой когерентностн.
Однако в литературе чаще используется циклированне фазы последнего импульса, по-видимому, с целью достижения удобства при программировании. Сдвиг по фазе этого импульса на 90' смешает фазу сигнала, который прошел через двухквантовую когерентностгн на 270'. Это можно понять, если представить себе, что мы имеем сдвиг на 90' относительно возбуждающей последовательности (что приводит к фазовому смещению на 180') я иос прямой 90 -сдвиг возникшей одноквантовой когерентностн. Если мы будем менять фазу последнего нмпульса по кругу в последовательности х, у, -х, -у, то фазу приемника следует менять в противоположном направлении (т.е.х, — у, — х, у) для того, чтобы следовать за двухквантовым сигналом.
Для подавления артефактов к этому четырехшаговому циклу можно добавить процедуру СУСЬОР8. Полезным может оказаться н смена фазы л-нмпульса. Имеются также дополнительные возможности, описанные в работе [1б]. В общем, размер реально необходимого фазового цикла лучше определять экспериментально для данного спектрометра, потому что никто не хочет без реальной необходимости увеличивать число прохождений на каждом шаге по 1,.
Квадратурное детектирование по в, требует, как обычно, сдвига на 90' фазы регистрируемого сигнала. Для сигналов, возникающих за счет двухкаантовой когерентности, это требует сдвига на 45" фазы возбуждающих импульсов. На современных спектрометрах это можно сделать непосредственно. Однако в то время, когда метод 1ХАПЕ( ()АТЕ только разрабатывался, спектрометры не были приспособлены для таких фазовых сдвигов, поэтому были разработаны два косвенных способа. Первый состоит в использовании так называемого составного в-импульса [17], т.е. последовательности где нет задержки между импульсами, а <р обозначает угол импульсав, соответствующий желаемому фазовому сдвигу (т. е.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
