А.И. Нетрусов, И.Б. Котова - Микробиология (1125593), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Рост и развитие микроорганизмов У одноклеточных форм понятия «рост» и «развитие» почти равнозначны. Различаюг сбалансированный рост, когда увеличение всех веществ и структур происходит пропорционально. Если в среде есть нехватка или избыток чего-нибудь, то рост становится несбалансированным, т.е. какие-то продукты метаболизма могут преобладать.
Этим приемом пользуются для направленного синтеза необходимых соединений. Келцчеетвецвая оценка роста микроорганизмов. Из-за малых размеров микроорганизмов оценка роста происходит не лля индивидуального организма, а для популяции. Графическое отражение процесса называется кривой роста. Чтобы правильно оценивать рост культуры, необходимы следующие простейшие параметры: ° концентрация клеток, клеток/мл; ° время генерации — промежуток времени, за который число клеток удваивается; ° константа скорости деления — число удвоений в час; ° константа скорости роста. Количественная оценка роста микроорганизмов требует определения числа клеток в конкретный момент.
Все эти методы подразделяют на прямые и косвенные. Прямые методы предполагают непосредственный подсчет клеток под микроскопом — в счетных камерах или на фиксированных мазках. При этом подсчитываются и живые, и мертвые клетки, к тому же такой подсчет возможен только для достаточно крупных микроорганизмов, не образующих агрегаты.
К косвенным методам относятся высевы на твердые питательные среды, осаждение на мембранных фильтрах. определение параметров, пропорционально зависящих от количества клеток (биомасса, высушенная на фильтрах постоянной массы, мутность суспензии, общий азот, белок, поглощение кислорода и выделение углекислоты). Следует помнить, что нет универсального метода, лишенного недостатков.
Любой метод имеет свои ограничения. Например, не все клетки способны дать колонии на твердой среде, нет питательной среды, подходящей для всех без исключения микроорганизмов, и т.д. 75 Культивирование микроорганизмов Накопительные и чистые культуры мпквввргапизмов. Из-за малых размеров микроорганизмов работа в лаборатории проводится не с одной особью, а с популяцией организмов, или культурой. Культура микроорганизмов, состоящая из клеток одного вида, носит название чистой кулыяуры.
Если число видов два или больше, то говорят о смешанной культуре. При выделении чистой культуры из природных местообитаний, где микроорганизмы в большинстве случаев растут в виде смешанных популяций, на первом этапе обычно пользуются предложенным С. Н. Виноградским методом получения накопительных культур, в которых преобладают организмы определенной группы. Накопление желаемых микроорганизмов происходит за счет создания элективных условий культивирования, благоприятных для данной группы.
Другие организмы, также присутствующие в пробе, в этих условиях либо не размножаются, либо характеризуются незначительным ростом. Периодическое культпвпроваппе. Обычно при росте в жидких средах в закрытых сосудах определенного объема микроорганизмы находятся в закрытой системе. Такое культивирование называют периодическим, при этом популяция проходит разные фазы своей жизни (рис. 64).
Каждая фаза характеризуется определенными физиологическими параметрами. Паг-фаза — фаза «привыкания» клеток к среде, при этом происходит индукция соответствующих ферментов, увеличение количества ДНК и РНК. Лаг-фаза удлиняется, если использовать старый посевной материал и переносить клетки в совершенно новую по составу среду. Лаг-фаза сокращается (или может совсем отсутствовать), если активные молодые клетки из экспоненциальной фазы роста перенести в свежую среду того же состава и той же температуры. На средах, содержащих смесь субстратов, наблюдается диауксия (рис. 65). В эксноненциальной (логарифмической) фазе клетки растут и делятся с максимальной скоростью, их рост не ограничен. Обычно такие клетки используют в биохимических и физиологических исследованиях. По мере исчерпания субстратов и накопления продуктов обмена скорость роста снижается (фаза замедления роста) и культура переходит в стационарную фазу, в течение которой процессы деления и отмирания клеток в популяции находятся в динамическом равновесии.
Для бактерий эта фаза достигается при концентрации в среднем 10«клеток/мл, для водорослей и простейших— 1О' клеток/мл. Когда исчерпание питательных веществ и накопление продуктов метаболизма преодолеют некие пороговые концентрации, 76 Фаза Станнонарзамедления няя фаза 5 Фаза 4 е 3 Й' $2 м Ю О 0 1 2 3 4 5 б 7 8 9 10 Время. ч роняя Рнс. 64. Рост культуры прн периодическом культивировании начинается фаза отмнрания, которая иногда также имеет логарифмический характер. При росте в экспоненциальной фазе увеличение количества клеток !т', происходит в геометрической прогрессии: 2о — з21-з -з 2з-з ...
— з 2" и через некоторое время! определяется по формуле зУ, = зУо 2", где )то — начальное количество клеток; и — число делений. Прологарифмировав это выражение, получим 1ВЖ = 1ВЛо + п!В2. Откуда и = (10)уз — 1в!уо) /!К2. Тогда константа скорости деления Рис. 65. Двухфазный рост Е. сол на среде, содержащей глюкозу н сорбнтсл 77 8 м 7 б м 4 й 3 о ' 0 о ч и / г ( 1 К Ф з 1 К ( о ) / 1 а 2 ( ! го ) 2 4 б 8 10 121416 Га 20 2224 2628 30 Время, ч время генерации 8= г/и = ! /а. Самые быстрорастущие организмы — фотобактерии — удваиваются каждые 8 мин.
Е. сой в оптимальных условиях делится через 20 мин. Если массу одной клетки принять равной 2. 10 ц г, то при неограниченном росте через 48 ч клеток станет 2,2 104', т.е образуется 10х' г биомассы, что в 130 раз больше массы Земли. Например, сравним продуктивность 500 кг биомассы разных организмов за ! сут (привес): корова — 0,5 кг (масса морской свинки); соя — 5 кг (масса кошки); дрожжи — 50 000 кг (масса 10 слонов). Экспоненциальный микробный рост изображается на полулогарифмическом графике в виде прямой линии. Важной характеристикой культуры является константа скорости роста — р, которая зависит от условий выращивания (если условия стандартные, то для данной культуры она совершенно определенная).
Если рассматривать популяцию не как набор индивидуальных особей, а как саморазмножающуюся систему, то скорость изменения плотности такой системы пропорциональна самой плотности, т.е. изменение следует кинетике реакций первого порядка. Тогда имеем 1 сПЧ Н= Ф Ф или, проинтегрировав, !у = Ф„ . е~'. После удвоения количества клеток 2%о = !Уо. е"', или 2=ем или (после логарифмирования) 1п2 = ргд. Откуда время удвоения (время генерации) 1п2 1 га = — = 8 = — и Р = ч 1п 2. Подставив ч, выраженное через количество клеток, и перейдя к десятичным логарифмам, получаем р = (18Ф,— 18йр)/18е (г — го) = (!8%с-!8!уо)/0,4343(г — га). Считается, что в экспоненциальной фазе роста все клетки живые и рост клеточной массы строго пропорционален увеличению количества клеток. Под урожаем (или выходом) биомассы понимают разность между максимальной Х„,„и исходной Х, массой бактерий: Х = Х вЂ” Х„(г сухого вещества).
Важное значение имеет экономический коэффициент, т.е. отношение урожая клеток к количеству потребленного субстрата, г: )'= Х/Х Применяют также энергетический коэффициент, г/молей )лтр = Х/АТР. Для его расчета нужно знать катаболические пути использования данного субстрата. Иногда необходимо, чтобы все клетки в популяции делились одновременно (синхронно). Для этого используют различные приемы получения синхронных культур: ° получение клеток одного размера путем фильтрации или дифференциального центрифугирования; ° резкое изменение температуры инкубации; ° воздействие света и т.д. При этом кривая роста получается ступенчатой (рис. 66). Обычно удается синхронизировать не более трех делений, а потом культура снова переходит к асинхронному делению.
ь Ы ' 5 о 4 И 33 Й "г о ~ О 0 ! г 3 4 5 6 7 Время, ч Рис. 66. Кривая роста синхронной культуры Непрерывное (проточное) культивирование. Проточная система культивирования позволяет зафиксировать культуру в какой-то определенной фазе (обычно экспоненциальной). При этом состав среды и условия роста остаются постоянными. Простейшая схема проточного ферментера предРис. 67. Схема проточного фермен- ставлена на рис. 67. Подача светера жей среды и удаление части суспензии (проток) происходит с той же скоростью, с какой растет культура.
Существуют два принципиально разных типа непрерывных культур — хемостат и турбндостат. В хемослгалге фиксируется какой-нибудь химический параметр процесса (концентрация субстрата, кислорода). Эта концентрация является лимитирующей. Если объем сосуда обозначить через У, а скорость притока 7" (л/ч), то скорость разбавления определяется по формуле )7= ОУ. Если бы бактерии не росли, то скорость вымывания была бы равна Их б„= — —.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
