Biokhimia_T1_Strayer_L_1984 (1123302), страница 7
Текст из файла (страница 7)
НС1. Далее аминокислоты полученного гилролизага разделяют методом ионообменной хро- 2. Основные представления о структуре и функции белков 27 О Ниигидрии Оихвявеквиии виюции Рис. 2.26. матографии на колонке с сульфонированным полистиролом. Фракционированные аминокислоты определяют по окраске, образующейся при нагревании с нннгндрнном: а-аминокислоты лают с нингидрииом интенсивное синее окрашивание, а иминокислоты, например пролин,— желтое.
Метод ионообменной хроматографии обладает высокой чувствительностью: Оеъви Аминокислоты, содержащиеся в гидролизате белка, разделяют методом ионообменной хроматографии на сульфонированном полистироле (например, дауэкс-50). Для злюции аминокислот с колонки используют буферы с возрастаюшим значением рН.
Первым снимается с колонки аспартат, имеюший кислотную боковую цепь; аргинин с основной боковой цепью элюируется последним. По оси ординат отложено поглощение. Часть 1 Конформации и динамика с его помощью можно определить даже один микрограмм аминокислоты, т.е, примерно столько, сколько содержится в одном отпечатке пальца. Количество аминокислоты пропорционально оптической плотности раствора после нагревания с нингидрином. Если требуется определить еше меньшие количества аминокислоты— порядка нескольких нанограммов, то используют флуорескамин, который реагирует с а-аминогруппой, образуя сильно флуоресцирующее соединение.
О природе аминокислоты судят по объему элюции, т, е. по объему буфера, использованному для вымывания данной аминокислоты с колонхи (рис. 2.2б). Сравнение результатов хроматографии гндролизата со стандартной смесью аминокислот свидетельствует о том, что исследуемый пептнд имеет следуюший аминокислотный состав: (А)а, Агй, Авр, Ыу, Р)зе).
Скобки показывают,что речь идет о составе, а не последовательности аминокислот в пептиде. >а.оо-сн га >О ООО Оо Н О о !! Н Н вЂ” С вЂ” С вЂ” 6!у — Азр — Ртге — Агй — 6!у — С 2 СН. О !ч )чо Мечеиие Н Н О ! лг От!ч Н вЂ” С вЂ” С вЂ” 6гу — Азр — РГге — Агй — 6!у — С / О СН, !ЧО Гидропиз Н Н О ! 02 / Н вЂ” С вЂ” С вЂ” О !чо 6!у Азр 6!у Рне Агн Рве.
2.27. Н3С,гСНг ы !чО гЧОт Е оторднннтреаентеп 80 С! 2. Основные представления Дпненпппернд о структуре и фугипвщ белков 29 Определение Х-концевого остатка пептида. Пептид метят фтординитробензолом (реактив Сэнгера) и затем гидролизуют. ДНФ-производное аминокислоты (в приведенном примере ДНФ-алании) идентифицируют по хроматографическим характеристикам.
Для определения в белке или пептиде концевого остатка, несущего аминогруппу, его метят с помощью соединения, образующего стабильную ковалентную связь с азатом аминогруппы (рис. 2.27). Впервые для этой цели Сэнгер использовал фпгординипграбензол (ФДНБ), реагирующий с незаряженной з-)ч)Н,-группой с образованием динитрофенильного !ДНФ) производного пептнда желтого цвета Связь между ДНФ и концевой аминогруппай стабильна в условиях, используемых лля гидролиза пептидных связей. Поэтому при гидролизе ДНФ-производного пептида А!а-О!у-Азр-РЬе-Агй-О)у в б н.
НС! высвобождается ДНФ-аминокислота, которую можно щгентифицировать хроматографически как ДНФ-алании. Для идентификации г)-концевых аминокислот в настоящее время часто используют донсилхлорид, который при взаимодействии с аминогрупцои дает стабильное, интенсивно флуоресцирующее сульфамидное производное. Этот метод позволяет выявить )х)-концевую аминокислоту (после кислотного гидролиза пептидных связей), присутствующую в ~аком незначительном количестве, как несколько нано> раммов. При всех дос>оинствах методов определения >ч-концевь>х вминокислотных остатков с помощью ДНФ или лацсилхлорида их, к сожалению, нельзя использовать дважды применительно к одному и тому жс пептиду, поскольку послелний полностью распадается при кислотном >идролнзе.
Перу Эдману (Р. Ед>пап) удалось разработать метод маркирования (н(-концевого остатка и отшеплеиия его от пептида без сопутс>вующе>о расщепления остальных пептидных связей, Дв'ридиция ио )джин)' (рвикцин Эд>щии) состои> в ступенчатом (по одному) огщснлснии вминокнслотных остатков с аминоконца псптида (рис. 2.2>)). Фвиилиютиоциаиил> реагирует с незаряженной концевой Овнивитотиоционвт аминогруппой пепгииа с образованием фснилтиокарбамоильного производного. Далее в слабокислой среде происхолнт отщеплецне циклического произволного )н(-капиевой аминокислоты, в оставшийся неразрушенным нептил оказывается укороченным на олин аминокислотный остаток.
Указанное циклическое производное представляет собой фенилтиогидантоин-ами>юкислоту (ФТГ-аминокислоту). Его идентифицирую> методом хрома>аграфии, Далее аминокислотный состав укороченного пептида (Агрн Азр, С1у>, Р)>е) сравнивают с исходным: (А1а, Агй, Азр, С!у„Р)>е). Оказь>вастся, ч>о различие состоит в одном остатке аланнна. Следовательно, в исходном пе>пиде алании занимает Х-концевое наложение. Деградацию по Эдману можно вновь повторить на укороченном пептиде. Исходя из амннокислотного состава после второй ступени дегралации (Агя, Азр, С!у, Р1>с) можно прийти к выводу, что вторым остат- Часть ! Конформация н динамика ком с )Н)-конца является глицин.
Это заключение подтверждают путем хроматографической идентификации ФТГ-глицнна. полученного на второй ступени де> радации псптида. Еще три ступени деградации по Элману позволяют полностью раскрь>ть последовательность аминокислот во взятом псптиде. Стратегию анализа последовательности аминокислот в белках можно определить как «разлеляй и властвуй». Белок подвергают гигцифи >в«киму риги>гилвнию пи болев корол>кис лели>и>) ы, поспелова> ельнос > ь аминокислот в которых определяют по Эдману, Специфическое расщепление можно производить химическими или ферментатнвным методами.
Так, Б. Уиткоп (В. >>((1>(>ор) и Э. Гросс (Е. Сгом) обнаружили, что бромистый циан (С!чВг) расщепляет полнцептидную цепь только по псптидной связи, образованной карбокснльной > руппой остатка метиаиини (рис. 2.29). Если в белке содержится 10 метиониновых остатков, то после обработки бромистым цианом обычно получается 1 ! пептидов.
Высокоспспнфическое расщепление достигается также с помощью трипсина- протеолитического фермента поджелулочной железы, Трипсин расщепляет полипептилные цепи по псптидной связи, образованной кврбоксильной группой ос>агков аргинина и лизина (рис. 2.30). В результате белок, содержащий 9 остатков лизина и 7 остатков аргиннна, после расщепления >рипсином распадается на >7 пептидов. Каждый из этих пептидов, кроме пептнда, расположенно>о на карбоксильном конце белка, будет кончаться аргинином илн лизином.
Ряд других способов специфического расщепления полипецтилных цепей цривелен в табл, 2.2. Пецтнды, полученные при специфическом химическом или ферментативном расщеплении белка, разделяют методами хроматографии. Далее последовательность аминокислот в каждом из пептидов определяют методом Эдмана. Таким образом, достигается этап, когла последовательность аминокислот в отдельных пептидах (фрагментах белка) известна, но остается невыясненной последовательность самих псптидов.
Последнюю устанавливают с помощь>о > ак называемых перс«рыками(ихгя лептпидов (рис. 2.31). При этом испальзук>т уже нс тринсин, а какой-либо фермент, рас>пепляющий полипептидную цепь в других участках, например хнмотрипсин, который расщспляет пептилные связи главным образам по двгрйддция по эдмдну ~ "г г — 2 — ( 3Я4Я5) ') р-!г' — г — КгН )-.Я ~~~>-, з т г -ДЗ-Щ-Щ ~;>- 2 -С2) — С4ЯЬ) — 2 ( 3Я4у — Сбу Первый цикл Отщелление Мвчвиив Втсрои цикл Феннлнвотиоцнвнат ,Π— 6!у — Аер — Р)ге — Агй — О~у — С О Гч=С=Б+ Мечение Π— 6)у.
-Авр — Рве — Агй — О)у — С" 'О Отщелление О Н В) — 6!у — Аер--Ркге — Агу — 6)у- С Пелтид, укороченный О нв один остаток ~-к с Фтг-аленин 2. Основные представления о структуре в функции белков Деградация по Элману. От пептидной пепи отшепляют меченый гч-концевой остаток аминокислоты (ФТГ-агзанин на первой ступени деградации), Остаток пептидной цепи при этом не гилролизуется. На вто- рой ступени деградации опрелеляют следующий гч)-концевой аминокислотный остаток. Еще три ступени деградации по Эдману позволят установить всю послеловательность аминокислот во взятом пептиле, н о + Н,Ут' — С вЂ”.С— н Рис, 2,29.
Реактив Химическое ресщепле- впе Брамистый циаи Гиироксиламип 2 Нитра.з-тиоц . «абеизовт фермсптативпее рас- щеплеиие Триполи Клострипаии Стафплакакковая протепиаза 32 но ноно смв — и — -С вЂ” С вЂ” Н вЂ” С вЂ” С -М вЂ” С -С-- ~~ Н и, Н СНт н и. ! СНз Б Сн Мвтиоиии Бромистый диан расщепляет полнпептиды по карбоксильной группе метиониповых остатков. карбоксильным группам ароматических и других больших неполяриых амииокнслотных остатков. Пептцды, образующиеся под действием химотрипсина, неизбежно перекрывают два или более триптических пентина, что используется лля установления их последовательности. Таким путем полностью определяют последовательность аминокислот в белке.
Описанные методы применимы к белкам, состоящим из одной полнпептидиой цепи, ие имеющей дисульфидных связей. В тех же случаях, когда в белке имеются днсульфндные связи или более одной полнпептидной цепи, то необходимы дополнительные методические приемы. Например, если белок содержит две или более полипептидные цепи, соединенные нековалеитными связями, то, воздействуя денатурирующими агентами, такими, как мочевина или гуанндингидрохлорнд, вызывают диссоциацию цепей. Диссоциированные пепи разделяют и только после этого приступают к определению последовательности аминокислот в кшкдой из иих.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
