Biokhimia_T1_Strayer_L_1984 (1123302), страница 6
Текст из файла (страница 6)
В процессе выделения и очистки белок отделяют от других белков и от небелковых соединений, исходя из таких его свойств, как размер Часть 1 Кеттрормацпв п динамика с.кснаеесй остаток молекулы, растворимость, заряд, гнвцифичвгкое !родсгаво гвчзыванил, Обычно применяют несколько разных методов очистки и сравнивают нх эффективность путем опредения интересуюшего белка по какому-то свойству. Например, ферменты определяют по удельной каталитической активности. При этом измеряют также и общее количество белка, что позволяет установить сте- Н Н О вЂ” и — С вЂ” С— СН Б Я СНз --.
Й вЂ” С вЂ” С— Н Н О Цнстнн Дисульфидный мостик ( — Я вЂ” Я - — ) образуется из сульфгидрильн ых групп ( — ЯН) двух остатков цистеина. Пролуктом реакции является остаток цигнтиии. Крупные мспекупы не прсхсант через мембрану Рис. 2.21, Разделение молекул по разме- ру путем диализа. пень очистки данного белка на каждом 15 килодальтон (кДа) остаются внутри этапе выделения. обычного диализного мешочка, тогда как Отделение белков от низкомолекулярных более мелкие молекулы и ионы проходят чевеществ проводят путем диализа через по- рез поры диализной мембраны и выходят из лупроницаемую мембрану (рис.
2.21). Бел- мешочка в диализат. кн, молекулярная масса которых превышает Дал ылои (Да)— единица массы, практически равная массе атома водорода (т.е. 1,0000 по шкале атомных масс). Терминами «дальтон» и «молекулярная масса» пользуются как взаимозаменяемыми; например, белок в 20000 дальтон имеет молекулярную массу 20000. Наименование дано в честь Джона Дальтона (17бб — 1844), разработавшего атомарную теорию строения материи. Килодальглои (кДа)— единица массы, равная 1000 дальтон.
Масса большинства белков лежи~ в пределах от 10 ло 100 кдал. Разделение белков по размеру молекулы проводят также методом гель-фильтрации (рис. 2.22). В этом случае пробу наносят на колонку из нерастворимого, но высокогидратнрованного углеводного полимера, состоящего из мелких частиц в виде зерен диаметром обычно О,1 мм. Обычно используют имеющийся в продаже сефадекс. Небольшие молекулы проникают внутрь частиц полимера, а крупные — нет. В результате низко- молекулярные вещества оказываются в водном растворе как внутри частиц, так н между ними, тогда как высокомолекулярные †водном растворе только между часпшами. Вследствие этого высокомолекулярные вещества, оказавшись в относительно меньшем объеме, быстрее проходят сквозь колонку н первыми снимаются с нее.
Разделение белков на основе различий в общем заряде осуществляется методом Крупные мопвкупы нв прониквют внутрь чвстиц попииврв .Ф Мвлкив иолвкупы рвстворпютоп в водили фазе внутри чвотиц попииврв цвотицв угпввод- ного полимера Рнс. 2.22. Разделение молекул по разме- ру методом гель-фильтрации. иоиаобмеиной хроматографии. Если белок имеет положительный заряд прн рН 7, то он обычно связывается на колонке нонообменника, содержащего карбоксильные группы, тогда как отрюгательно заряженный белок таким ионообменником не связывается.
Такой положительно заряженный белок снимают с колонки путем лобавления в элюирующий буфер хлористого натрия или какой-либо другой соли. При этом ионы натрия конкурируют с положительно заряженными группами белков за места связывания на колонке. Те белки, у которых плотность положительного заряда ниже, вымываются с колонки первыми, за ними следуют белки с более высокой плотностью положительного заряда. Помимо общего заряда на поведение белков при ионообменной хроматографии оказывают влияние н другие факторы.
Общий заряд белка определяет также и скорость его миграции в электрическом поле. На этом принципе основан метод оттек»трофореза, который мы подробнее обсудим в одной из следующих глав (разя. 5.3). Здесь яге стоит отме~ить высокую разрепуающую способность метода электрофореза. Так, используя двумерный электрофорез, удалось получить более 1000 различных фракций при однократном разделении белков такого простого организма, как бактерия Е.сой (рис.
2.23). Еше один мощный и универсальный способ очистки белков — хроматография ло сродству (аффиииая хроматография). В основе метода лежит характерное для многих белков высокое сродство к специфическим химическим группам. В частности, расти- 2. Основные представления о структуре н фувжцнн белков 25 Бепак, свкзыввющии гпюкозу Добевпеиие гпюкозы,г) Рнс. 2.23.
Рис. 2.24. 2б . ° в а *. кы Двумерный злектрофорез белков Е. со(й Метод позволяет выявить более 1000 различных белков этой бактерии. Разделение происходит на основе различий в изоэлектрической точке белков (злектрофорез в горизонтальном направлении) и на основе различий в молекулкрной массе (вертикальный электрофорез). (Печатается с любезного разрешении д-ра Р.Н. О'багге)1.) тельный белок конканавалин А можно выделить из неочищенного экстракта, пропуская экстракт через колонку, содержащую ковалентно присоединенную глюкозу.
Конканавалин А, обладаюший сродством к глюкозе, связывается с колонкой, тогда как остальные белки, как правило, на колонке не адсорбируются. Далее связанный конканавалин А снимают с колонки концентрированным раствором глюкозы. При этом в участках связывания глюкозы в молекулах конканавалина А происходи~ замещение присоединенных к колонке остатков глюкозы на глюкозу, паходяшуюск в растворе (рис. 2.24). Итак, с помошью хроматографии по сродству можно выделять белки, которые распознают какую-то группу Х; для этого: 1) Х или ее производное ковалентио присоединяют к колонке; 2) наносят на колонку белковую смесь и затем не связавшиеся белки удаляют буфером; 3) элюируизт искомый белок, добавляя Х в виде раствора высокой концентрации.
Часть ! Конформации н динамика Высвободивиииоп бепок Хроматография по сродству (аффинная хроматография) конканавалина А (показан желтым) на колонке, содержащей ковалентно присоединенные остатки злюкозы (Г). 2,6, Последовательность аминокислот в белках уникальна и детермипнруетсн генамн В !953 г. Фредерик Сэнгер (лапает) определил последовательность аминокислот в белковом гормоне-.инсулине (рис. 2.25). Эта работи предстивляет собой веху в развитии биохимии, иба в ней впервые была показипо, что белок имеет строго определенную посл»- довательпогть аминокислот. Кроме того, это достижение послужило стимулом для других исследователей подвергнуть аналогичному анализу большое множество белков. И действительно, к настоящему времени установлена полная последовательность аминокислот у нескольких сотен белков.
Самое поразигелыюе, что каждый белок имеет уникальную, точно определенную последовательность аминокислот. В серии остроумных работ, проведенных в конце Гао-С~гг-А*гг-Туг-Суа-Аагг ?г 5 Последовательность аминокислот в инсулине крупного рогатого скота. Р . 2.25. называют также протсинами. Поспедннй термшк ввсдснный Барнелиусом в 1838 г.', подчеркивает важное значение этого класса веществ.
Термин образован ог греческого слона ртсгсе!оа, что оэначаес «первостепенный» Цапь А 5 Шу-яа.еак6Ы 6~п-Суа-Суа-А!5-5аг-чаосу«-5«гаао.туг 6М 5 го 5 Цепь Е 5 Рпа-Уа1 Аап-п~гг.нгь-оао-суа.п~у-заг Н адагг-Ча! 61»-А~а-Соо 5 го 50-х-начале 60-х годов было обнаружено, что последовательность аминокислот в белках детерминирована генетически. Последовательность нуклеотидов в ДНК вЂ” веществе наследственности -определяет комплементарную последовательность иуклеотидов в РНК, а последняя в свою очередь определяет сгоследова?ель?гость аминокислот в белке (г л. 25). Более того, синтез всех белков из соотвегствуюцсих аминокислот имеет единый механизм. Определение поспелова гельности аминокислот в белках представляет интерес по четырем причинам. Во-первых, такие данные имеют большое значение для выяснения молекулярной основы биологической активности белка.
Сведения о последовательности аминокислот приобретают особую ценность прн их сопоставлении с другими химическими и физическими характеристиками. Во-вторых, изучение последовательности аминокислог в сочетании с детальным анализом пространственной структуры необходимо для выяснения тех принципов, на основе которых из полипепБе.жи— 2.7.
Экспериментальные методы определения последовательности аминокислот Рассмотрим сначала, как можно определить последовательность аминокислот в корот- ком пептиде, Допустим, что пептид состоит из 6 амннокислотных остатков, располо- женных в следующей последовательности; А(а-С!у-Азр-РЬе-АТБ-О(у.
' Термин «протеин» введен Мулдером (1лебеп Г. ОсчсЬ(сЬГе бег РЬуь)о(овгасьеп СЬепне, 1.егрбя опд %?еп, 1. )3еосйсе, !935, 5. 359)5-Прим. ред. Ту .Сао Ч»Г Суа-6Гу.СГ».Агсл6Гу-Раа Рьа-Туг ТогРгацу«АГа ?о ?5 зо гидных цепей формируются высокоспецифичные трехмерные формы. При этом последовательность аминокислот в белке служит связующим звеном между генетической информацией, заложенной в ДНК, и трехмерной структурой белка, лежащей в основе его биологической активности. В-тресьих, изменения в последовательности аминокислот могут привести к нарушению нормальной функпии белка, а следовательно, и к соответствующей болезни. В частносги, такая тяжелая болезнь, как серповидно- клеточная анемия, нередко приводящая к легальному исходу, возникает в результате замены всего лишь олной-единственной аминокислоты в одном-единственном бслке. Таким образом, определение последовательносги аминокислог относится к новой области медипины — молекулярной пазологии, В-четвертых„данные о последовательности аминокислот в белке могут многое рассказа~ь о его эволюции.
Дело в том, что в неродственных белках эти последовательности совершенно различны. Белки лишь в том случае имеют сходную последовательность аминокислот, если они происходят от общего белка-предшественника. Следовательно, изучение последовательностей аминокислот в белках позволяет ггрослелить эволюцию на молекулярном уровне. (Для обозначения аминокислот использованы общепринятые сокращения, приведенные в табл. 2.1, стр. 23.) Прежде всего необходимо определить иминокисиигппый с оспгие лап?види. Для этого его гидролизуют до составляющих аминокислот нагреванием до 110ьС в течение 24 ч в 6 и.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
