Biokhimia_T1_Strayer_L_1984 (1123302), страница 58
Текст из файла (страница 58)
Часть ! 200 Конформации н динамика слойная мембрана обладает очень малой проницагмостью для ионов и большинства полярных молекул. Исключение из правила составляет вода, проникающая через такие мембраны. Экспериментально полученные коэффициенты проницаемости варьируют в широких пределах (рис. ! 0.15). Так, Ха+ и К проходят через мембраны в 10 раз медленнее, чем вода.
Триптофан, который при рН 7 является биполярным ионом, проходит через мембраны в ! Оз раз медленнее, чем индол, который сходен с триптофаном по структуре, но не несет ионизированных групп. Коэффициенты проницаемости для низкомолекулярных соединений коррелируют с отношением их растворимости в не- полярных растворителях к растворимости в воде. Эта зависимость дает основание думать, что низкомолекулярные соединения проходят сквозь двуслойную мембрану следующим образом: сначала ани теряют окружающую их гидратную оболочку, затем растворяются в углеводородном внутреннем слое мембраны, наконец диффундируют через этот внутренний слой к другой стороне мембраны, где вновь растворяются в воде.
10.7. Большицство мембранных процессов опосредована белками Обратимся теперь к мембранным белкам, ответственным за большинс~во динамических процессов, осуществляемых мембранами. Мембранные липиды создают барьеры проницаемости и тем самым отграничивают отдельные участки (компартменты), тогда как специфические белки опосредуют отдельные функции мембран, такие, как транспорт, передачу информации и преобразование энергии. При этом мембранные липиды создают среду, необходимую для действия этих белков.
Мембраны различаются между собой по содержанию белка. Так, в миелине, который служит изолирующей оболочкой многих нервных волокон, содержится мало белка (!8%). Основной компонент миелина — липид с прекрасными изоляционными свойствами. С другой стороны, в большинстве клеток плазматические мембраны обладают значительно более высокой активностью н содержат различные насосы, каналы, рецепторы, ферменты. Количество белка в таких плазматических мембранах достигает, как правило, 50;ы Наиболее высоким содержанием белка, вплоть до 75%, характеризуются мембраны, функционирующие как преобразователи энергии, в частности внутренние мембраны митохондрий и хлоропластов.
С помощью электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН) удается выявить основные мембранные белки. Н,С вЂ” (СН,)зе — СНзОЯО,(ь(а' Дадеинлсульфат натрия (ДСН) При использовании этого метода мембраны сначала солюбилизируют !%-ным раст.вором ДСН. Этот детергент разрушает большинство белок-белковых и белок-липцпных связей.
Далее полученный раствор наслаивают на полиакриламидный гель, также содержащий ДСН, и все это помещают на несколько часов в электрическое пале. В этой системе в отличие от других, не содержащих ДСН, электрофоретическая подвижность большинства белков зависит от их массы, а не от заряда. Дело в том, что отрицательный заряд молекул ДСН, присоединенных к белку, намного превышает общий заряд самого белка.
Полосы разделившихся белковых фракций проявляют, обрабатывая гель краской типа кумассн си- трнлтофан Индоп Мочеаина Глицероп н,о с~ Глюкоза 10-" 10 'з 10-'о 10 а 10-' 10 " 10-з Коэффициент проницаемости, омlс Увеличение проницаемости $~В Рнс. 10.15. Коэффициенты проницаемости липидных двуслойных мембран для некоторых ионов и молекул. ний.
При этом выявляются крайне малые количества белка-порядка нескольких микрограммов. На рис. 10Л6 показаны результаты гель-электрофореза трех мембран— плазматической мембраны эрнтропитов, фоторецепторной мембраны палочек сетчатки и мембраны саркоплазматического ретикулума мышцы. Отчетливо видно, что белковый состав этих трех мембран совершенно разнзый. Кроме того, мембраны различаются по набору входящих в их состав полипептидных цепей н по распределению массы. Таким образом, меибрины, выполняюзцие неодинаковые функции, различаются также по белковому составу.
10.8. Реконструкция функционирующих мембранных систем нз очищенных компонентов Большое множество мембранных белков было солюбилизировано и получено в очищенном виде (см. гл. 34 — 37). Некоторые из них сохраняют активность в растворе с детергентом. Например, фоторецепторный белок родопсин лает одну и ту же полосу поглощения 500 нм независимо от того, находится лн он в растворе детергента или же в составе мембраны сетчатки. Более того, в обоих случаях простетическая группа этого белка при освещении претерпевает одинаковые структурные изменения. Белок саркоплазматического ретнкулума мышц калсеквестрин, связывающий кальций, сохраняет способность связывать кальций и вне мембраны.
Из саркоплазматического ретнкулума был выделен также кальциевый насос (фермент Са" -АТРаза). Оказалось, что из смеси фосфолипида и белка кальциевого насоса могут образоваться функционально активные пузырьки, способные накапливать Саз+ в присутствии АТР как источника энергии. Реконструкция Рнс. 10.16. Электрофореграммы различных мембран в ДСН-полнакриламндном геле. А -плазматическая мембрана эритроцнтов.
Б †мембранн диски палочек сетчатки.  †мембра саркоплазматнческого ретикулума мышечных клеток. [Печатается с любезного разрешения д-ра Т. 81ес)г (рис. А) н д-ра О. Мас1.еппап (рис. В).) 1О. Введение в проблему бно.югических мембран сн, Н,С вЂ” (СН,), — СН,— и' — СН, Вь СН, Бромнд додецилтриметнламмонил ЩТАБ) НС СН, НьС С СНт С О (СНь СНт О), Н н,с сй, Полноксиэтилан л.т.октнлфанол (серии тритона Х) СОО На' он изменении рН. Согласно последним данным, периферические белки мембран в большинстве случаев присоединяются к поверхности интегральных белков. Для того чтобы определить, локализован ли данный белок во внутренней части мембраны, используют главным образом электронно-микроскопический метод замораживания — скалывания. Клетки или фрагменты мембраны быстро замораживают до температуры жьщкого азота, Замороженную мембрану раскалывают далее толчком ножа микротома.
Скол обычно проходит продольно посередине бнслоя (рнс. 10.19). В результате раскрывается значительная область внутренней части лнпидного бнслоя. Далее эту ФФФФФ ФЭ б Ф ЭЭФ а ЭФЭФФЭЭ Рис. 10.18. сн, НьС (СНт)~ь СНт' и О СН, Додацилдиматиламиноксид (ДДАО, аммоникс (.О) НО' О Халат натрии Рис. 10.17.
Структуры детергентов, используемых для солюбилизации н очистки мембранных белков. функционально активных мембранных систем из очищенных компонентов — наделений подход к изучению мембранных процессов. 10.9. От.дельные белки мембран глубоко погружены в лнпидный бислой Некоторые мембранные белки удается выделить методами мягкой обработки, например экстрагированнем раствором высокой ионной силы (напрнмер, 1 М )ч(аС1).
Другие белки оказываются более прочно связанными с мембраной — нх можно отделить лишь с помощью детергента (рис. 10.17) или органического растворителя. Исходя из различий в прочности связи с мембраной, соответствующие белки подразделяют на периферические и интегральные (рис. 10.18). Интегральные белки образуют многочисленные связи с углеводородными цепями мембранных липидов, н потому их можно выделить только с помощью агентов, конкурентно участвующих в этих неполярных взаимодействиях.
Периферические белки, напротив, связаны с мембранами электростатическими силами и водородными связями. Эти полярные взаимодействия могут быть разрушены при добавлении солей или Часп ! 210 Конформации и динамика Интегральные белки (а, б, в) мембраны образуют большое число связей с углеводородными цепями бислоя. Периферические мембранные белки (г) присоединяются к поверхности интегральных белков. носительно инертной мембраны, функцио- нирующей главным образом в качестве изолирующей поверхности.
Рнс. 10.19. Электронно-микроскопический метод замораживания — скалывания. Плоскость скола проходит посередине мембраны бислоя. 1э(пйег 8.1., Нозр. Ргас!., 8, 8! (1973).1 обнажившуюся поверхность покрывают путем напыления слоем угля или платины, что дает реплику внутренней части бислоя. Для изучения наружной поверхности мембраны метод замораживания †скалыван используют в сочетании с методом глубокого травления. При этом сначала путем скола обнажают внутреннюю часть замороженной мембраны.
Далее высушивают лед на прилежащей поверхности мембраны — это метод глубокого травления. Сочетание двух методов, называемое электронной микроскопией с применением замораживания— травления, позволяет получить картину внутренней части мембраны и обеих ее поверхностей. Достоинство рассматриваемого подхода состоит в том, что он не требует фиксации и обезвоживания биологического материала. В исследованиях методом замораживания — травления было непосредственно доказано присутствие интегральных белков во многих биологических мембранах. Например, в мембране эритроцита содержатся глобулярные частицы высокой плотности диаметром около 75 А (рис.
10.20). Большое число глобулярных частиц имеется также внутри мембраны саркоплазматического ретикулума. В отличие от этого искусственный бнслой из фосфатиднлхолина имеет совершенно гладкую поверхность скола. Оказались большей частью гладкими и поверхности скола миелиновой мембраны, что и следовало ожидать от этой от- 1О.
Введение в проблему биологических мембран 211 10.10. В мембране эрнтроцнтов содержатся различные периферические н интегральные белки В работах по изучению мембран эритроциты оказались наилучшим объектом исследований, поскольку они легко доступны и относительно просто устроены. Будучи лишены органелл, эритроциты имеют только одну мембрану — плазматическую.
Путем осмотического лизиса можно получить тени эритроцитов, т.е. чистые плазматические мембраны, без цитоплазмы. На рис. 10.21 показаны результаты электрофоретического разделения белков такого мембранного препарата на полиакриламндном геле, содержащем ДСН. При окрашивании кумасси синим проявляется более десяти полос. Основные полосы пронумерованы и обозначаются как полосы 1, 2, 3, 4.1, 4.2, 5 и 6 (рис. 10.21).
При окрашивании иодной кислотой — реактивом Шиффа (РАБ-реакция)' выявляется несколько белковых фракций, богатых углеводами. Эти полосы обозначаются соответственно РАБ-1, РАЯ-2, РАБ-3 и РАЯ-4. Где локализуются рассматриваемые белки в мембране эритроцита7 Белки, соответствующие полосам 1, 2, 4.1, 4.2, 5 и 6, экстрагируются из мембран при повышении ионной силы раствора или изменений рН; следовательно, они расположены на периферии мембраны.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
