С.Г. Инге-Вечтомов - Генетика с основами селекции (1117682), страница 22
Текст из файла (страница 22)
Сталя (по А. Ленинджеру, 19761 ДНК (рис. 6.7): 1) консервативный, при котором новые молекулы не содержат материала родительской ДНК; 2) лолукоисервативиый, при котором новая молекула представлена одной родительской и одной вновь синтезированной цепями; 3) дислерсный, когда материал исходной молекулы случайно распределяется в обеих дочерних молекулах. Эксперимент М.
Мезельсона и Ф. Сталя позволил сделать выбор между этими тремя вариантами (рис. 6,8). Главный вопрос — как различать исходные молекулы ДНК и молекулы-потомки — был решен благодаря привлечению нового в то время для биологии метода — равновесного центрифугирования в градиенте плотности СзС!. При этом для мечення вновь синтезируемых молекул была использована утяжеляющая (плотностная) метка — изотоп азота (аг(.
Для этой цели клетки бактерии Е. сой в течение нескольких дбелений выращивали на среде с единственным источником азота ' ХН(С!, так что вся ДНК оказывалась равномерно помеченной "И и имела плотность 1,724 г/смз в отличие от плотности обычной ДНК (1,710 г/см'), содержащей только "Х. Такие образцы тяжелой и легкой ДНК можно разделить, если их смесь ультрацентрифугировать в градиенте плотности СзС1. При помещении 6М раствора СзС! в центрифужные пробирки и при ускорении 1068 в течение 20 ч создается градиент плотности раствора.
Каждый тип молекул седиментирует до тех пор, пока не достигнет зоны своей плотности. М. Мезельсон и Ф. Сталь в своих экспериментах использовали аналитическую ультрацентрифугу, в которой фиксировали распределение ДНК в ультрафиолетовом свете с длиной волны 260 нм, которую поглощают нуклеиновые кислоты. Смесь тяжелой ("Х) и легкой ((ЯХ) ДНК давала две зоны поглощения аз Направление седимен галии — + тяжелая днк ж Ролительская ДНК Легкая ДНК с двумя Смесь зяжелои и легкой днк жлз Смесь тяжелои ~ я днк из клеток поколения днк из клеток Н + — две репликапии поколения Н! +' Репликадии Рис. Ь.К Сяезяв зксперимента М. Мезельсона и Ф.
Стиля, доказавшего полуконсер вативнмй механизм реплнкации ДНК [из А,ленинджера, !978) Г24 УФ-света. Если бактерий, выращенных на среде зМ, переносили на среду с ')з) и давали им делиться только один раз, то ДНК, экстрагированная из них, собиралась только в одной зоне, поглощающей УФ-свет. Положение вновь синтезированных молекул оказывалось промежуточным — между тяжелой и легкой ДНК. Этот результат исключает консервативный механизм репликации Если бактериям давали делиться на обычной среде дважды., то появлялся пнк легкой ДНК н сохранялся пик ДНК промежуточной плотности, не исчезавший н прн последующих делениях. Этот результат противоречит днсперсионному механизму репликации. Таким образом, именно полуконсервативный механизм лежит в основе репликации ДНК.
В соответствии с этим механизмом ДНК, появляющаяся после первого деления клеток на обычной среде и занимающая промежуточное положение в градиенте плотности, должна представлять собой фракцию гибридных молекул. Тогда одна нить (старая) должна содержать только зМ, а другая (новая) — только "Х. Чтобы в этом убедиться, нужно суметь разделить «старую» н «новую» нити. Сделать это сравнительно просто: нужно нагреть ДНК до 100'С. Прн этом разрываются водородные связи между основаниями, но сохраняются все ковалентные связи. Происходит так называемое плавленне нлн денатурацня ДНК.
Как показали М. Мезельсон н Ф. Сталь, если выделить ДНК промежуточной плотности н расплавить ее, т. е. прогреть в течение 30 мнн прн 100'С, быстро охладить н вновь центрнфугнровать в градиенте плотности, то обнаружатся два пика, один нз которых по плотности соответствует денатурированной легкой ( ~)ч(), а другой — денатурированной тяжелой (~~И) ДНК. Полуконсерватнвный механизм реплнкацнн ДНК, доказанный М.
Мезельсоном н Ф. Сталем, оказался столь же универсальным для воспроизведения генетического материала, как н сама структура ДНК. Более того, в тех сравнительно редких случаях, когда генетнческнй материал представлен одноннтевой ДНК, как, например, у бактернофаув крХ-174 н некоторых других, прн нх воспроизведении в клетке синтезируется так называемая реплнкатнвная (двуннтевая) форма (РФ) . Эта РФ далее реплнцнруется на основе полуконсерватнвного механизма.
Доказательство полуконсерватнвноуо механизма реплнкацнн ДНК послужило н первым прямым доказательством справедлнвостн модели Дж. Уотсона н Ф. Крика. Полуконсерватнвный механизм реплнкацнн показан также для мнтотнческнх хромосом высших животных н растений, в частности для хромосом бобов — )!!с!а !'аЬа. Дж. Тэйлор помещал проросткн )!.
)аЬа в среду, содержащую тнмнднн, меченный трнтнем, на время одного (нлн части) клеточного цикла. Это ЬУ Рнс. Ь.9. Схема раснределения мечениото тп тимидина при удвоении хромосом Ус!с!а !айа !оо Дж. Тэйлору, !963!. Пунктирная лини» изойраяает меченую субъединику хромосомы, сплоюная — немечсную. Точки — зерна засвеченной фптозмульснн на радноавтотрафе. 1 — удвоение в присутствии хн-тимидниа, 11 -- первая иетафаза после включения метки, 111 --удиоенис в отсутствие хп-тнмидина, 1Р— втораа мстафатв после аключеняя метки !25 приводило к тому, что хромосомы оказывались равномерно меченными 'Н, что фиксируется авторадиографически. Затем проростки переносили в среду без радиоактивной метки, но содержащую колхицин.
Последний применяли для того, чтобы дочерние хроматиды не рйсходились, а оставались в одной клетке (см. гл. 4). Во время первой метафазы в «холодной» (без»Н) среде мечеными оказывались обе дочерние хроматиды, а в следующем делении в метафазе одна хроматида оказывалась меченой, а другая немеченой. Эти результаты свидетельствуют о полуконсервативном воспроизведении ДНК хромосом (см.
схему рис. б.9) и совместимы с представлением о том, что митотическая хромосома содержит одну двунитевую молекулу ДНК. 6.3. Энзимология репликации Модель Уотсона — Крика дает общее молекулярное описание структуры и функции генов, предполагает принцип репликацни генетического материала. Доказательство полуконсервативного механизма репликации ДНК заставило по-новому взглянуть на основные характеристики двойной спирали Уотсона — Крика. Для того чюбы понять, как работает полуконсервативный механизм репликации, необходимо ответить на вяд вопросов: как разделяются комплементарные нити ДНК, закрученные одна вокруг другойу Какая ферментативная система воспроизводит ДНК с учетом антипараллельности ее цепей и др.
Первый обнадеживающий результат на пути к пониманию ферментативного механизма репликации ДНК 'был получен А. Корнбергом (отцом) в 195б г., когда он выделил из клеток бактерии Е. соИ фермент ДНК-полимеразу. Этот фермент осуществлял синтез ДНК при наличии в реакционной смеси всех четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов: АТФ, ГТФ, ТТФ, ЦТФ и молекул ДНК: лдхтФ ДНК-полл- лдГТФ дГМФ дцтлв + ЛНК вЂ” ИЛПЛЗЛ вЂ” — »л~ цмФ + ДНК + «л ФФ„ лдТТФ (лтМФ~ В такой реакции количество ДНК ужличиввлось в 20 раз по сравнению с' внесенным изначально. По своему нуклеотидному составу вновь синтезированная ДНК неотличима от исходной.
Реакция полностью зависела от присутствия всех четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов. Казалось бы, осуществлена репликация ДНК (п тйго. Однако если в реакции А. Корнберга использовали трансформирующую ДНК, то ее трансформирующая активность в результате реакции не возрастала. Оказалось, что ДНК-полимераза не является истинной «репликазой». Что же происходит в реакции Корнберга? Дело в том, что при выделении из клеток ДНК рвется, так что образуются фрагменты с одноцепочечными 5'-концами. !26 Масок ккч нить пт При этом каждый фрагмент с 5'Р одноцепочечным 5'-концом иси Рс +- — « для полимеризации комплемен-,„„„", 3'ОН тарных нуклеотидов, которые рнс й Ю.
Скеиатическое июбражение связываются с ней водородными фрагмента дНК, а котором различают связями. Более короткая цепь иатричную и татрааочиую нити <сплоснфрагмента, имеющая свободный Пунктир — напраклеиис роста цепи ДНК, 3~-конец, служит в качестве за- спит*парусной днк-полинсрааой й а рсакг)ззвкн, нлн праймериз, к которо- нии А. карабана му ковалентно присоединяются полимеризуемые нуклеотиды (рис.
6.10). Таким образом, ДНК- полимераза А. Корнберга достраивала двуцепочечные участки на концах фрагментов ДНК, после чего реакция останавливалась. Дальнейшие попытки выделить из клеток бактерий истинную репликазу были связаны с применением генетических методов. Были получены мутанты ро)А с условным проявлением (в частности, температурочувствительные), лишенные при непермиссивных условиях активности Д(!К-полимеразы 1, как стали называть фермент А. Корнберга. Эти мутанты сохраняли жизнеспособность даже при непермиссивных условиях.
Это еще раз подтвердило, что ДНК-полимераза ! не является ферментом, реплицирующим ДНК !и Ито. Из таких бактериальных мутантов Т. Корнберг (сын) и другие выделили еще два фермента: ДНК-полимеразу П и ДНК-полимеразу Ш. Эти ферменты также «умели» достраивать двунитевые участки на фрагментах ДНК с однонитевыми 5'-концами. В дальнейшем было показано, что именно ДНК-полимераза 1П участвует в синтезе полинуклеотидных цепей при репликации ДНК Е. со((. У этого объекта были выделены условно летальные мутанты по гену йта Е, кодирующему ДНК-полимеразу П1. Тем не менее ни одна из трех ДНК-полимераз Е.
сой не может инициировать репликацию ДНК в отсутствие уже готового праймера (затравки). Начало синтеза ДНК вЂ” инициацию репликации — осуществляет иной фермент. Им оказалась РНК-полимераза, кодируемая геном тула С. Таким образом, в качестве затравки при репликации бактериальной ДНК ДНК-полимераза Ш использует полирибонуклеотид, синтезируемый на матрице ДНК. Эти короткие (около 10 звеньев) молекулы РНК в 'дальнейшем — в ходе роста цепи (элонгации) — удаляет ДНК-полимерзза 1, которая кроме полимеразной активности в направлении 5' — 3' растущей цепи обладает 5' - 3'-экзонуклеазной активностью, т.
е. способна отщеплять нуклеотиды с 5'-конца. Благодаря объединению этих двух активностей в одной молекуле фермента ДНК-полимераза 1 удаляет РНК-праймер и одновременно заполняет образующуюся однонитевую брешь, полимеризуя дезоксирибонуклеотиды. Кроме этих двух активностей ДНК-полимераза 1 имеет еще и третью— 3' - 5'-экзонуклеазную. Благодаря этой активности ДНК-полимераза 1 осуществляет так называемые корректорские функции, удаляя ошибочно включенные в ДНК основания.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
