С.Г. Инге-Вечтомов - Генетика с основами селекции (1117682), страница 24
Текст из файла (страница 24)
Он есть у всех изученных бактерий, за исключением М(сгососсих гайог(игапг, который тем не менее чрезвычайно устойчив к действию ультрафиолетового света: он выдерживает дозы, в 1000 раз более высокие, чем те, которые убивают Е. сой. При полном отсутствии способности к фотореактивации М. гаЖойигапз обладает мощной системой эксцизионной репарации. Эксцизионную репарацию, т. е. связанную с удалением поврежденного участка ДНК„ называют также репарацией по типу выщепления — замещения или более образно «механизм режь— латай» (рис. 6.17). Эксцизионная репарация не столь специфична в отношении повреждений ДНК, как фотореактивация, тем не менее наиболее подробно изучена именно репарация ДНК, содержащей тиминовые димеры.
Этому способствовало то обстоятельство, что возможность фотореактивации клеток — критерий присутствия тиминовых димеров в ДНК. Появление димеров приводит к локальной денатурации ДНК, что влечет за собой нарушение процесса репликации: каждый тиминовый димер в ДНК Е. со(( задерживает репликацию на 10 с. Доказательство существования и изучение механизма эксцизионной репарации стало возможным благодаря получению мутантов Е. со((, чувствительных к летальному действию ультрафиолетового света, Если штаммы Е. со((, устойчивые к ультрафиолетовому свету, инкубировать в темноте после облучения, то из их ДНК удаляются тиминовые димеры. У мутантов, чувствительных к ультрафиолетовому свету, этого не происходит.
Эксцизионная репарация представляет собой многоэтапный процесс и заключается в: 1) «узнавании» днмера, 2) надрезании одной цепи ДНК вблизи димера — инцизии, 3) удалении димера— эксцизии, 4) ресинтезе ДНК и 5) восстановлении непрерывности репарируемой цепи за счет образования ковалентных связей сахарофосфатного скелета молекулы (рЯС. б.17). «Узнавание» повреждения в ДНК осуществляет фермент УФ- эндонуклеаза, который реагирует не только на димеры тимина, но и на многие другие изменения, приводящие к локальному йарушению структуры ДНК. Эндонуклеаза ответственна и за инцизию, т.
е. надрезание одной цепи ДНК (разрыв фосфодиэфирных связей) непосредственно около димера с 5'-конца в поврежденной цепи. Эксперименты ш т(гго с облученной ДНК показали, что число однонитевых разрывов оказывается равным числу димеров в молекуле.
гм Реппикация Репаративный синтез чк, Фрагментация ДНК при выделении Ф Зона плотности обычной ДНК Зона плотности гибридной ДНК фракционираеание Обычная ДНК Гибрнднан ДНК Г~ 'Н и Обычная ДНК Рнс. 6.18. Схема опыта Д, Петтиджона и Ф. Хзнеуолта, доказываюнгая сунгествование репаратнвного синтеза ДНК в клетках Е, той, облученных ультрафнолетовгем светом (по К. Смиту, Ф. Хзнеуолту, 1р721; Я вЂ” реплнкатнвный сянтез ДНК; Б — репаратнвнмй синтез ДНК 135 л И н х х о х о. О н сз н х о с и с .6. н х х Ю 'гх 2 а б 6 10 2 л 6 в 10 Номер фракции Эксцизию, илн вырезание димера из молекулы ДНК, осуществляет другая нуклеаза.
Димер удаляется в составе короткого олигонуклеотида (3 — 5 оснований), что может сопровождаться дальнейшей деградацией поврежденной спирали. Продукты деградации облученной ДНК, содержащие тнминовые димеры, можно обнаружить в клетках. У некоторых бактерий димеры находили и в культуральной среде. Деградацию ДНК осуществляет АТФ- зависимая ДНКаза. В результате эксцизии и последующей деградации ДНК образуются однонитевые бреши, или пробелы. Ресинтез ДНК, в результате которого заполняются бреши, идет с использованием в качестве матрицы ннтактной цепи.
Такой репаративный синтез ДНК напоминает «дополнительную» репликацню, обнаруженную в пахитене у эукариот. Прямое доказательство репаративного синтеза у бактерий получили Д. Петтиджон и Ф. Хэнэуолт, использовавшие для этой цели метод М. Мезельсона и Ф. Сталя (рнс. б.18). ДНК Е. сой метили '4С, выращивая клетки в присутствии радиоактивного тимина, а затем изучали репликацию в присутствии 5-бромурацила, меченного Н.
В результате нормальной репликацни (рис. 6.18, А) при центрифугировании в градиенте плотности можно наблюдать смещение пика распределения молекул: при этом бромурацил играет роль плотностной метки. В соответствии с этим гибридные молекулы ДНК оказываются меченными '4С и Н.
При изучении тем же методом ДНК, выделенной из облученных клеток, обнаруживали только один пик, соответствующий по плотности исходным молекулам. Тем не менее эти молекулы содержали как "С„так и небольшое количество 'Н (рис. б.18, Б). Этот пик радиоактивности появлялся вследствие включения 5-бромурацила в ДНК в ходе репаративного синтеза. Однако фрагменты ДНК, содержащие 5-бромурацил, столь невелики (в среднем пять нуклеотидов на один димер), что не влиякп' на плавучую плотность молекул, извлекаемых из клетки. Подтверждением предложенного объяснения наблюдаемой картины служило, во-первых, то, что фотореактивацня снимала ресинтез ДНК: исчезал дополнительный пик радиоактивности 'Н; во-вторых, репаративный синтез не отмечался у мутантов, не способных выщеплять димеры тимина.
Механизм синтеза ДНК, наблюдаемый в ходе репарации после ультрафиолетового облучения, получил наименование нелолуконсервативного. Основной фермент, ответственный за эксцнзию димеров н репаративный синтез ДНК, — это ДНК-полимераза 1, кодируемая геном ро! А. Тем не менее у мутантов ро( А, дефектных по ДНК- полимеразе 1, все же наблюдается остаточный репаративный синтез, который связан с активностью ДНК-полимеразы П.
Известно, что неполуконсервативный синтез ДНК в 99 случаев происходит на коротких участках длиной до 30 нуклеотндов. За эту реакцию ответственна ДНК-полимераза 1. В 1 / случаев синтез идет на гораздо более длинных отрезках — 1000 †15 нук- гм леотидов. По-видимому, эту реакцию и осуществляет ДНК-полимераза Н. Последний этап эксцизионной репарации заключается в восстановлении нелрерыеносги репарируемой цепи ДНК с помощью фермента ДНК-лигазы, кодируемого геном ((4 Е. со6.
Температурочувствительные мутанты по этому гену не способны не только завершать процесс эксцизионной репарации в непермиссивных условиях, но и накапливают фрагменты Оказаки при репликации ДНК. Различные варианты эксцизионной репарации широко распространены у про- и эукариотических организмов. Она обнаружена у простейших (например, Те(гасйтела дуг()ого), в культуре клеток млекопитающих. Удаление тиминовых димеров из клеток млекопитающих сопровождается так называемым внеплановым синтезом ДНК, который происходит по репаративному типу: вне Б-фазы клеточного цикла. Он аналогичен пахитенному синтезу ДНК в мейозе.
Внеплановый синтез ДНК показан в зародышевых клетках и на постмейотических стадиях гаметогенеза у самцов мыши после действия этилметансульфоната. В ходе эксцизионной репарации у млекопитающих включается в среднем 20 новых нуклеотидов на каждый тиминовый димер. Известна мутантная линия клеток китайского хомячка с ослабленным (по сравнению с исходной линией) внеплановым синтезом ДНК, проявляющая повышенную чувствительность к ультрафиолетовому свету. Нарушения процессов репарации ДНК обнаружены у людей, пораженных наследственным заболеванием — пигментной Ксеродермой.
Известно несколько типов этой болезни: ХР1, ХРП, ХР,.„ общими симптомами которой служит повышенная чувствительность к солнечному свету, приводящая к развитию рака кожи. Культура клеток больных ХР1 чувствительна к ультрафиолетовому свету, но не к ионизирующим излучениям. У этих больных дефект эксцизионной репарации связан с отсутствием активности УФ- эндонуклеазы.
В культуре клеток здоровых людей после облучения ультрафиолетовым светом в дозе 10 Дж/м' через 20 ч из ДНК исчезает до 90),' тнминовых димеров (со скоростью 40000 димеров в час), в то время как в клетках больных ХР1 димеры вообще не удаляются нз ДНК. Тип ХРП чувствителен как к ультрафиолетовому, так и к рентгеновскому излучениям. Клетки ХРП не способны репарировать ДНК, имеющую однонитевые разрывы.
По-видимому, это связано с отсутствием в них фермента, аналогичного ДНК-полимеразе 1 Е, со(Е Наконец, в клетках больных третьего типа — ХР... выщепление димеров тимина идет нормально, а дефект связан с иным типом репарации — пострепликатнвной. Постреплнкативная репарация Этот тип репарации (см.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
