И.Ф. Жимулёв - Общая и молекулярная генетика (1117666), страница 49
Текст из файла (страница 49)
Следует также учитывать, что клоны в библиотеке кДНК представляют зрелые, т. е, прошедшие процессинг, мРНК. Они не содержат интронов. У эукариот только мРНК содержат поли(А)'-хвосты. Используя это качество, мРНК выделяют. Затем в системе т гйго к этой мРНК добавлянэт короткую цепь олиго(дТ). которая после отжига служит в качестве праймера для действия обратной транскриптазы (РНК-зависимой ДНК-полимеразы), синтезирующей комплементарную цепь ДНК на молекуле мРНК (происходит как бы обратная транскрипция: РНК -» ДНК). Далее с помощью РНК-азы Н, ДНК-полимеразы 1 и ДНК-лнгазы удаляется цепь РНК, на ее месте синтезируется новая ДНК-цепь, фрагменты которой лигируются (рис.
7.19). После того как молекулы кДНК синтезированы, их готовят для клонирования. К молекулам кДНК с помощью ДНК-лигазы фага Т4 добавляют линкерную ДНК вЂ” относительно короткий двунитчатый фрагмент длиной 8- 12 пн (рис. 7.20). Линкер содержит сайт узнавания одной из рестриктаз. По этому сайту клоны кДНК лигируют с векторной ДНК. Для того чтобы выявить клоны, находя7циеся в библиотеках, и выделить их, сущест- 162 ОБЩАЯ И МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНГТИКА попп(АГ-хппст Дпухцспочечпая «ДНК ъьРНК 5 ,„„„3 ПРисппдццсцип З пдито~ь)Т) пряймсря ,,зьз 3 тггттт Оорььтцяя з трпцскРвцццд Комплекс 5 мРНК:кДНК 3' 3 ДНЕ-ппппмеразп 1 5 3 Двойная спираль хДНК ь ьлзязз ттьттэ Разрушена .
мР11К з РИК-язой Н Дпстрзввпцве второй цппц ДНК-цьппоь тьззой 1 е вецпльзпвяпвсм фььшьч втов РНК з п япчсстпс прайм Зьпв т!гхть 5 ДНК-ппгазп сшивает фсзпч |ьть ь Д"И' тьгьть Синтез двунитчатой комплемеьпарной ДНК нз полн!А)'-РНК с использованием обратной транскрнптазы, РНК-азы Н, ДНК-полнмеразы ! и ДНК-лигазы 1Кььззе!1, !998. Р. 462! вуют различные способы, суть всех их состоит в скринировании библиотек.
Рассмотрим, как скринируют библиотеки, т. е. анализируют и выделяют клоны, заключенные в А-фатах !рис. 7.1)). Сначала выращивают газон бактерий Е. со)ь', на который помещают суспензию фагов, содержащих геномные клоны. В тех участках, где фаги инфнцировали бактерии и размножились, образуется бляшка 1р!аь)це), т. е.
как бы дырка на поверхности газона Е. со- Д. Каждая бляшка состоит из большого числа потомков одиночной фаговой частицы, размножившихся в инфицированных и лизированных бактериях. Всякий раз, когда бактерия лизируется, освобождаются не только упакованные фаговые частицы, но и неупакованная фаговая ДНК. На этот газон на несколько минут кладут мембранный фильтр, в результате чего ДНК из бляшки связывается с ним.
Последующая обработка фильтра щелочным раствором приводит к денатурации ДНК на одиночные нити. После этого фильтры инкубируют с меченым зондом. Гибридизация меченого зонда с ДНК из бляшки выявляется в виде темного пятна засветки на фотопленке. По положению засве- 5 ИЬАГЕ4:.. 3 3 ЮСг ьР.АОЕь 5 ДНК-яигяза фага Тз двцксрм з Т ггхяйп~гяпсзп ягпт~яптяпп я я Разрезание ВапьН1-дицкерпп ха хяяПШяг) 3 48 пйьйьА:.б 5 Встряипяцие в вектор, рпзрпзявный цп ВитН1 з фо:6 .фф:,:)966 оъ' ' Клонирование фрагментов кДНК с использованием линкеров, содержащих сайьт рестрикции ВитЕ!! 1Кпззе!1. )998. Р. 463) ченного пятна находят бляшку на газоне.
Фаги с этой бляшки можно собрать и, инфицирован новые бактерии, размножить фаги, а следовательно, н клон до количеств, необходимых для молекулярного анализа. Литература к разделу 7.4.3 Нцяяе!1 Р. й. Оецейсз. 5а еь). Мец!о Раг)с, Са!!Гога!а: Айьйзоц %ез!еу Еоцйщац !цс., 1998. Р. 460 — 468. 7.4.4. Построение рестрикционных карт Поскольку клонированные последовательности ДНК представляют собой гомогенную популяцию молекул ДНК, расщепление их под действием рестриктаз приводит к образованию более мелких дискретных фрагментов. С помо- Гласи 7. СТРУКТУРА ГЕНА Мембрана Отл" влныс бляшки Чашка Петри с газоном бактерий и бляшками, образованными фатом 2 Получ .нис отпечатков фаговой ДНК на мембране Мембрана с фаговой ДНК Фш щ шенка Гнорид фвговой ДПК с радиоактивным тонном Отмывка мсмораны, дснатурация ДНК и гибридизация с радиоактивно мечеными зондами ! серый цвет) Отмывка от избытка зонда н дегскния гиорилизаиии с помощью аввзрааиографии Пятно засветки указывает на бляшку, содержащую фагн с необходимой ДНК Скринннг библиотеки 2-фагов н выделение индивидуального фага, содержащего клон ДНК !йияяе11, !998.
Р. 463! щью специального анализа можно определить расположение рестрикционных фрагментов в молекуле ДНК, т. е. построить рестрикционную карту. Существует несколько способов построения рестрикционных карт. Для того чтобы получить точную, детальную и полезную для работы карту, чаще всего не ограничиваются только одним из них. Наиболее употребительными являются следующие: 1.
Одновременное расщепление ДНК несколькими рестриктазами. 2. Последовательное расщепление выделенного рестрикционного фрагмента. 3. Частичное расщепление немеченой ДНК или ДНК, меченной по одному концу. 4. Частичное расщепление ДНК экзонуклеазами с последующим расщеплением рестриктазой.
Какой из этих методов использовать в каждом конкретном случае, зависит от многих причин. По размерам образующихся фрагментов ДНК удается определить относительное местоположение по крайней мере некоторых ОБЩАЯ Н МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТ11КА 1б4 Клонпрованпые лпнсйньгс фраглгептьт ДНК длиной 5 тпп Разр«занис рсстрикгазами н злсктрофорсз в агарозном геле м е Дянппые фрагменты Короткие фрлпяепти 11спореяиппия ДНЕ 4,5 лги 0,5 пги Есои! Построение рестрикционной карты 3 тпп 2 тпп Ваги!1! Вспн! Ваги Н ! 0,5 тпп 2,5 тпн 2 тпн Окончательная рестрикционная карта Построение рестрикционной карты по сайтам рестриктаз ВсоК1 и ВатН1 [гьпяяе!1, 1998 Р 471~ Рассмотрим простейший пример рестрикционного картнрования (рис 7 22) Допустим, что был клонирован фрагмент ДНК длиной 5 тпн.
Одну аликвоту ДНК обрабатывают рестрикгазой Всоси, другую — — ВапгН1, третью —— смесью обеих рестриктаз После электрофоре- Построение калибровочной кривой по длине маркерных фрагментов н определенно длины анализируемых фрагментов участков расщепления. С увеличением числа парных комбинаций ферментов увеличивается число участков, локализац!и которых установлена, вплоть до полуп!ения окончательной картины В результате получается карта рестрикционных сайгон | Длина пробега 5 тпп 5,0 4,5 5,0 'Я 2,5 2,0 й 0,5 -% 165 Главк 7. СТРУКТУРА ГЕНА Электрофорез:;:;;~,'::,:! Перенос в агарозвом гслс '!:.'"::.'.:,' на фильтр Разрезание рсстрнктазамк Хромосомная ДНК Фрагменты ДНК Ипкубация фильтра с радиоактивным зондом Отмывка и экспозиция ';„:;-'; ) фильтра с фотопленкой Проявление Подоиовио фри конто.
гомалогвчкого радиоактивному зонду Схема Саузерн-блот гибридизации тического разделения фрагментов можно определить их размеры, сопоставляя с размерами известных фрагментов ДНК !маркеры размеров ДНК). После электрофореза гель окрашивают бромидом этидия и фотографируют в ультрафиолетовом свете. На фотографиях измеряют расстояния, пройденные тем или иным фрагментом от старта. Для маркеров с известным молекулярным размером также определяют расстояние, пройденное со старта, и строят калибровочную кривую.
Затем на этой кривой находят положение каждого фрагмента по длине пройденного пути и определяют его размер. В конкретном случае 1см. рис. 7.22) очевидно, что после обработки Есой) появляются два фрагмента — — 4,5 и 0,5 тпн. Это свидетельствует о наличии только одного сайта рестрикции, и этот сайт находится на расстоянии 0,5 тпн от одного из концов исходного фрагмента. По этой же логике есть только один рестрикционный сайт ВптН1, удаленный на 2 тпн от одного из концов. При совместном гидролизе двумя рестриктазами получаются три фрагмента: 2,5, 2,0 и 0,5 тпн.
Расположить эти фрагменты непротиворечиво с данными„полученными при действии каждой из рестриктаз в отдельности, можно лишь так, как это сделано на окончательной рестрикционной карте. В реальных экспериментах построение рестрикционных карт — - гораздо более сложный процесс. Лилэерагпура к разделу ?.4.4 Маиивтис Т'., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. Ыс Мир, 1984. С.
337 — 338. Кивке!1 Р. Л. бепе11св. 5ь еб. Мел!о Раг1с, СаИопиа: Авц|воп %ев1еу 1.опбшап 1пс., ! 998. Р. 469 — 471. 7.4.5. Саузерн-блот анализ Для картирования хромосомных перестроек на физической карте, определения положения гена, выявления повторов, «хромосомной ходьбы» и т.
д. используется Саузерн-блот анализ, изобретенный Э. Саузерном в 1975 г. Для разделения фрагментов ДНК обычно используют электрофорез в агарозном геле. ДНК в геле денатурируют и к гелю прикладывают нитроцеллюлозный фильтр. ДНК переносится на фильтр, где фиксируется обработкой высокой температурой или ультрафиолетом. Эта процедура напоминает прикладывание промокательной бумаги к тексту с еще не высохшими чернилами (от англ. Ыон1пб — промокание). После ряда дополнительных процедур все фракции ДНК, разделившиеся в геле в результате электрофореза, оказались перенесенными на фильтр !рис.
7.23). Фильтр затем помещают в гибридизационный буфер, в котором находится зонд, меченный радиоактивным изотопом или химическим путем. Этот зонд свяжется с комплементарным участком ДНК. После промывки фильтра можно приступить к выявлению сигна- !66 ОБЩАЯ И МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА Инверсия РР в Н Н 0,5 2,5 2,0 в Ь 7,0 й Зила — фрягиеит Есой(-Нйнй !! 2,5 тшс в+'и,":-", 2,5:,.' -"-''' » Фрагмент 2,5 исчез ач-с:: '; -2,0 Картироваиие точки разрыва инверсии ив геиомиой карте ДНК с помощью Свузери-блот гибридизации ла. Если зонд был радиоактивным, к фильтру прикладывают рентгеновскую пленку и выявляют участок засветки. Если зонд мечен с помощью химических модификаторов, то детекцию проводят на том же фильтре.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
