И.Ф. Жимулёв - Общая и молекулярная генетика (1117666), страница 48
Текст из файла (страница 48)
Образуется одноцепочечная молекула Т-ДНК, переносимая из бактерии в ядро растительной клетки и встраиваемая в ее хромосому посредством механизма, аналогичного процессу бактериальной конъюгации (см. гл. 5). Таким образом растение приобретает трансген, встроенный в Т-участок плазмиды. Наличие маркерных генов позволяет легко отобрать трансформированные клетки или растения на средах, содержащих соответствующие антибиотики или гербициды !йпззе!1, 1998; Першина, 2000).
158 ОБЩАЯ И МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА СУТ КВ Т-область б В РВИХ 7373 пн ОЙ7 У!К С01ч Т1-~лазмнда (Першина, 2000. С. 581. Т-область — ДНК плазмиды, переносимая в ядро клетки растения: 1.В и К — левая и правая границы Т-области; А ОХ и СУТ вЂ” гены. контролирующие синтез ауксина и спэтокинина в трансформированной клетке и индуцирующие рост опухолевых клеток; РОВ -- ген, контролирующий синтез нопалина (источника углерода, азота и энергии в трансформированной клетке!; У1К, СОМ и Олг -- области вирулонтностн, коньюгации и независимой реплнкации Характерной особенностью митохондриальных геномов многих высших растений, таких как пшеница, сорго, просо, подсолнечник, сахарная свекла, кукуруза, является присутствие в их составе, помимо основной высокомолекулярной ДНК, видоспецифичных наборов кольцевых и (или) линейных автономно реплицирующихся молекул плазмидоподобных ДНК (ппДНК).
Например, у кукурузы сорта «Черный мексиканец» в митохондриях находят основную кольцевую молекулу размером около 570 тпн, а также мини-линейную и минн-кольцевые ДНК размерами 2,3 тпн и 1,9 и 1,4 тпн соответственно. Интактные митохондрии и митохондриальные ДНК можно использовать в качестве векторной системы в экспериментах по переносу генов в клетки животных и растений. Один из векторов, разработанных на основе мини- кольцевой ппДНК, показан на рис. 7.12. Наиболее часто используемые фи овые векторы являются производными фага 2. Левое и правое плечи фага имеют все гены, необходимые для литического цикла; напротив, гены, контролирующие лизогению и расположенные между плечами, удалены.
Такие модифицированные фап! проходят литический цикл, но лизогения не происходит. Между двумя плечами ?.4.2.2. Фаговые векторы Р.Г71пс полн(А)'-сигнал 355 промотор и~!!!!!;! урра! ! !\! Р' .-;.:".Ф ~ ~ ОКЕ ИРТП ~ЯЯ1ЯЯЯ и ВВ Генетическая карта вектора РВАМ-1, построенного на основе митохопдрнальной плазмиды (Таусон н др., !9991. В-61пс — ген В-глюкуронидазьп КВБ! — сайт связывания рибосом (участок митохондрнальной плазмиды 1,9 тпн1; ОКР— открытая рамка считывания митохондриальной плазмиды 1,9 тпн; ЛК — участок ннипнацин репликации мнтохондриальной плазмнды 1.9 тпн; ХРТП вЂ” — ген неомицннфосфотрансферазы; Одг — ориджин реплнкации бакгериальцой пяазмиды рйо!Д: Лр' — — ген ампициллин-резнстентности помещается заменяемый фрагмент ДНК, который не нужен для развития фага (рис.
7.13). На стыке заменяемого центрального фрагмента и каждого из плеч находится один и тот же сайт рестрикции, например ЕсоК!. Другого такого сайта в плечах данного фага нет. В ходе клонирования ДНК фага и клонируемый фрагмент ДНК обрабатывают рестриктазой ЕсоИ, затем смешивают, отжигают и лигируют стыки цепей. В частицу фага л может упаковаться ДНК длиной 37-52 тпн, на плечи приходится около 30 тпн, т. е. размер вставки может быть 7- 22 тпн, в среднем около 15 тпн. Фаги без вставок или, напротив.
со слишком большими вставками не развиваются и не поражают бактерии. На газонах Е. сой выедаются так называемые бляшки (р!аццея) фагами, имеющими вставки нужного размера. Некоторые бактериофаги имеют относительно большие геномы, что позволяет внедрить в них крупные фрагменты чужеродной ДНК.
У одного из таких фагов, Р1, геном размером ! 10-115 тпн упаковывается в белковую оболочку. В генно-инженерных опытах компоненты Р! включают в кольцевую плазмиду (рис. 7.14). После этого плазмидный вектор Р1 разрезают на 2 плеча, в которых лигируют до 100 тпн чужеродной ДНК. Затем рекомбинантный фаг пошощается подходящей клеткой-хозяином. Глояо 7. СТРУКТУРА ГЕНА Ьсон! ДНК фага 2 З4 Гзо Н! Кланирусмаа ДНК В4 ЕС44К1 5 3 5 3 5 3 5 45 п4н 3 3 5 0~~3 Кс 4н! Левое плечо - 15 тпн Правою плечо В -Я ° ° ° ' Рсстрикпиошгыс фрагменты различного размера Нс Ю4ияет на рс!юикацню фага А Плечи содержат вес плгы, В нсобхолимыс лдя рспликапии.
по ьлиппагм малы для упаковки .3 Р " 'В5 т Упаковка ДНК а частицу фага 2, варах!ение клеток К сод для размножения фага и клонирования ДНК Схема клонирования ДНК с использованием фага 2 в качестве вектора 1йпззе11, !99в. Р. 4561 Ролликов род Упаковка ° В ~ еа Вяяянв Р1 рсьомоинант 1тлл4Н! 4Р чужеродной Ф ДНК Дгс 11н гнческий репли кон Р! Заржксние ктсткн Е со1! сге Гсо с4е а хромосоме К соб Замыкание ° Белок сгс в кольцо С 44ОЧОЩЬН1 рекол4биназы сге Схема клонирования в векторе фага Р1. Плазмида Р1 содержит различные элементы генома Р1: Рог — саят упаковки, два сайта 1охР !опознаются фаговой рекомбиназой, кодирусмой геном гге). Вектор разрезается так, что получаются 2 плеча: короткое и длинное, в которое лигируются 75-100 тпн ДНК.
Упаковка рекомбинантной ДНК происходит 4п Щло с использованием упаковочных экстрактов Р1: расаяе расщепляет рекомбинантную ДНК в сайтах Рос 1олР 4ВВ .у 7 в В 5си! РВР322 ' ;, Рис 1охР Алощифнкация ° Инлткпия литическогс цикла фага Р! плазмиды Разрезание Зал4Н1и Яги1 Э Встраивание 44 до 75-! 00 тли !с эжп ° л 5 3 3 5 40рщмснт повхцкящспз размера Лля упаковки 5, 3 ' !6О ОБЩАЯ И МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА Святы лля злсвврсззнвя с! сч! св з Ар 2квдтс!с нас! ссь-сзйт Плазмида УЕр24 7,769 тпн пи Ьтр! су,! Космилпый вектор лля клонирования !князе!1, 1998, Р. 456) ч 4фя с! Космиды в природе не встречаются, онн созданы искусственно в результате комбинации плазмид и фага 2.
Космида имеет последовательность ог1, позволяющую ей реплицироваться в Е. со!1, доминантный селекционный маркер Ар" н уникальные сайты рестрикции для инсерций и клонирования фрагментов ДНК !рис. 7.15). Кроме этого космиды имеют созсайт, происходящий нз фага 2. Соз-сайты— это участки, в которых многочисленные копии геномов 2-фага, объединенные в длинную цепь, называемую конкатамером, разрезаются на фрагменты длиной 48 тпн, пакуемые в фаговые головки.
Соз-сайты фага в введены в плазмиду, в результате получаются небольшие космиды размером около 5 тпн. Когда фрагменты ДНК размером 35-47 тпн встраиваются в такую космиду, молекула достигает нужной длины, чтобы упаковаться в фаговую частицу. Этот фаг затем вводится в клетку Е. соЕь Размер клонируемого фрагмента ДНК в космидном векторе составляет 35-45 тпн.
Это векторы, которые способны реплицироваться в двух н более организмах-хозяевах. Плазмида УЕр24 (рис. 7.16), способная размножаться в клетках дрожжей и Е. со11, имеет последовательность оп', позволяющую реплицироваться в Е. со11, и селекционные маркеры Ар", Тс" (Е. со1!) и 11ЕАЗ !контроль биосинтеза урацила для клеток дрожжей), а также последовательность 2р-с!ге!е, специфичную для дрожжей и позволяющую реплицироваться автономно в дрожжевой клетке.
Левое плечо 5,6х !О'пв Правое плечо 3,9 х !О' пп ГЕЬ ГКР! Структура тАС-вектора !Кпззс!1, 1998. Р. 458) 7.4.2.3. Космидные векторы ?.4.2.4. Челночные векторы Челночный вектор УЕр24 между клсткзын Е. сол и дрожжей !впззс!1, 1998. Р. 457). Показаны уввкзвьвыс санты рсстрвкцвв 7.4.2.5. Искусственные хромосомы дрожжей !'УАС) Векторы этого типа имеют следующие элементы: 1) теломеры на каждом конце; 2) центромерные последовательности !СЕАс); 3) селекционные маркеры на каждом плече 1ТЕР1 и И~АЗ -- независимость от наличия триптофана и урацила соответственно); 4) автономно реплицирующиеся последовательности — АЕЕ, позволяющие реплицнроваться в дрожжевой клетке; 5) рестрикционные сайты, уникальные для участков УАС и пригодные для инсерций ДНК !рис.
7.17). Клоны ДНК вводятся в клетки дрожжей трансформацией. Отбирая по маркерам ТЕР1 и !1ЕАЗ, можно быть уверенным, что данный клон имеет и левое, и правое плечо вектора. 4КЗ СЕЮ !СКАЗ Рсстрвкциовпый сайт для клонирования до !О'пн 161 Глааа 7. СТРУКТУРА ГЕНА Размеры клонируемых последовательностей ДНК велики: обычно несколько сот тысяч пар нуклеотидов и даже больше. Алиханян С. И., Акифьев А. П., Черпни Л. С. Оби!ая генетика. Мс Высш. шк., 1985. С. 420-425.
Дейнеко Е. В. О потенциальных возможностях использования Т-ДНК почвенных бактерий Л Вести. ВОГиС. !998. Х 4. С. !2-!4. Лугова Л. А. и др. Генетика развития растений. СПбс Наука. 2000. С. 395 — 436. Першина Л. А. Мезоды культивирования га кйга в биотехнологии растений: В 2 ч. Ч. 2.
Новосибирск: Изд. Новосиб. гос. Ун-та, 2000. Ь9 с. Впаяей Р. 3. Оспе!гск 5ь ед. Меп!о Рагк. Са!1!Ьгп(а: Адд!зоп !Уез!еу 1.оо8шап !пс., 1998. Р. 454-492. Япхпуа Н., В!ггеп В., Кйп П.-Л. е! а!. С!ошп8 апд а!аЫе шсдп!епапсе оТ300-'к!1оЬаае-ра(г !гайшеп!з о! Ьшпап ОНА 1п Езсаепс(на сай агдп8 ап Р-(ас!ог-Ьааед яес!ог Л Ргос. Ха!. Асад. 8сй ГВА. 1992. Уо!. 89. Р.
8794 — 8797. 7.4.3. Создание генояяных библиотек Коллекция клонов ДНК, содержащая хотя бы по одному экземпляру каждого из фрагментов ДНК, входящих в состав генома данного вида, называется геномной библиотекой. Аналогичные коллекции, полученные из индивидуальных хромосом или их частей, называют хромосомными библиотеками. Получение геномных библиотек включает выделение тотальной ДНК, фрагментацию ее с помощью рестриктаз, присоединение полученных фрагментов к векторным молекулам (плазмидного или фагового происхождения) и введение рекомбинантных ДНК в реципиенские бактерии. Известно три подхода, применяемых при создании геномных библиотек: 1.
Геномная ДНК полностью переваривается рестриктазой и затем заключается в клонирующий вектор. Недостатком этого метода является то, что размеры клонируемых инсерций довольно малы: около 4 тпн. 2. ДНК фрагментируется механическими воздействиями (обработка ультразвуком, пропускание через иглу шприца), что позволяет получить более крупные фрагменты — 20- 150 тпн, однако из-за отсутствия у них нлипких» концов необходимы дополнительные манипуляции. 3.
Применяется частичное переваривание рестриктазами. Это означает, что только часть имеющихся сайтов рестрикции используется ферментом для разрезания (рис. 7.18). Эта техника позволяет получить набор клонов бактерий или рекомбинантных фагов, раз- Литература к разделу 7.4.2 Получение серии перекрывающихся фрагмензов с одинаковыми «липками» концами путем частичного переваривания ДНК рестриктазами. Вертикальными линиями помечены рестрикционные сайты, стрелками — фрагменты ДНК личающихся по включенным фрагментам ДНК.
Первую геномную библиотеку создали Т. Маниатис с сотрудниками в 1978 г. Они использовали ДНК из генома 27. те(пподалег, которую клонировали в клетках Е, сори Копии ДНК, комплементарных РНК (комплементарная ДНК, кДНК, нли сПЫА), могут составлять библиотеку кДНК. Поскольку библиотека кДНК отражает спектр генной активности в клетках, из которых была выделена РНК, создание и анализ таких библиотек особенно полезны для сравнения генной активности в клетках разных типов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
